基于解旋酶等温扩增技术的新型冠状病毒核酸可视化检测方法的建立

目的运用逆转录解旋酶等温扩增(RT-tHDA)和侧流层析技术,建立新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测新方法。方法收集2020年1至4月东部战区总医院基础医学实验室共143份2019-nCoV PCR阴性核酸标本和20份PCR阳性核酸标本。针对2019-nCoV N基因和E基因保守区序列各设计5对引物,扩增产物进行凝胶电泳分析,筛选出RT-tHDA最佳引物。分别扩增高浓度(5×10^(5)拷贝/ml)、低浓度(5×10^(2)拷贝/ml)模拟标本,利用侧流层析试纸条(LFD)检测RT-tHDA扩增产物,使结果可视化。优化显色和扩增时间,建立tHDA-LFD最佳反应体系。该方法检测各低、中、高3种浓度的模拟标本15次,以阳性符合率来评估方法学精密度。制备模拟标本评价方法学检测限。分别检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、冠状病毒229E,评价tHDA-LFD法的交叉反应性。采用tHDA-LFD法检测本实验室收集保存的163份标本,进行临床诊断效能评价。结果采用一步法RT-tHDA结合LFD,建立扩增时间为60 min的2019-nCoV核酸检测方法。该方法检测3种浓度的模拟标本,阳性符合率为100%,精密度和重复性较好,且与其他6种呼吸道病原体均未出现交叉反应。该方法检测N基因、E基因的最低检测限均为5×10^(2)拷贝/ml。诊断效能评价结果显示,该法敏感度为95.00%(19/20),特异度为100.00%(143/143),阳性预测值为100.00%(19/19),阴性预测值为99.31%(143/144)。和金标准qPCR法相比,两种方法的Kappa值为0.971(P<0.0001),一致性较好。结论本研究成功建立了基于tHDA-LFD法的2019-nCoV可视化检测方法。

解旋酶依赖性等温扩增快速检测O157:H7及其毒力基因的研究

目的建立一种快速、特异的检测大肠杆菌O157:H7及其毒力基因的解旋酶依赖性等温扩增法(HDA)。方法以大肠杆菌O157:H7的溶血素基因(hly)、粘附抹平因子(eae)和O抗原编码基因(rfb)为扩增对象,设计3对特异性HDA引物,通过优化条件后进行灵敏度和特异度试验,并与普通PCR法比较。结果 HDA法从标准菌株和实验室分离株中均扩增出hlyA、eaeA和rfb基因片段,产物大小分别为100、93和109 bp,而其他非大肠杆菌O157:H7的扩增结果均为阴性。通过对各梯度大肠杆菌O157:H7菌悬液的检测表明HDA法可以检测的最低菌液浓度为3.0×101cfu/ml,该法与普通PCR法灵敏度相当。结论本HDA法具有较高的灵敏度和特异度,可快速、高效地检出大肠杆菌O157:H7菌和其毒力基因,而且对试验仪器要求低,特别适合应急处置现场和基层检验机构作为临床大肠杆菌O157:H7感染的辅助诊断。

依赖解旋酶DNA等温扩增技术的研究进展

依赖解旋酶DNA等温扩增技术(HDA)是近年来发明的一种新型的模拟动物体内DNA复制的等温扩增技术,HDA具有简便、高效、快速的优点,不需复杂的科学仪器,反应在常温下进行,适用于基层实验室,具有广阔的应用前景。

基于RT-HDA等温扩增技术快捷检测H7N9禽流感病毒的方法研究

常规PCR方法不适宜于实验条件不足的基层现场检测H7N9禽流感病毒,不利于疑似病例的及时诊治。本研究旨在建立一种快速简便、高灵敏度、低成本的H7N9禽流感病毒快速核酸检测技术。选用H7N9禽流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)基因作为靶标区域设计引物,采用FITC和Biotin标记上下游引物,通过逆转录解旋酶依赖性等温扩增(Reverse transcription helicase-dependent isothermal amplification,RT-HDA)技术扩增病毒RNA,辅以胶体金免疫层析试纸检测核酸扩增产物,建立H7N9禽流感病毒等温扩增检测方法。采用H7N9禽流感病毒质粒和病毒培养物对该方法的灵敏性、特异性和重复性进行评价,结果显示:病毒最低检测限20个拷贝数/μL,与常规PCR方法相比较无明显差异,重复性试验一致,与其他型别的禽流感、流感病毒无交叉反应。本研究建立的RT-HDA联合胶体金免疫层析试纸检测H7N9禽病毒检测方法具有较好的灵敏度、特异性和重复性,特别适用于现场条件下检测H7N9禽流感病毒快速简便的检测。

沙门菌tHDA等温扩增检测方法的建立

目的建立基于依赖耐热解旋酶核酸等温扩增(t HDA)的沙门菌快速检测方法。方法从Gen Bank数据库下载沙门菌侵袭蛋白A(inv A)基因,比对确定保守区并设计t HDA引物,并对引物浓度、硫酸镁以及氯化钠浓度等反应条件进行优化。同时评价方法的特异性和灵敏度,并检测模拟样本和真实样本以验证方法的可靠性。结果建立的沙门菌t HDA检测体系经过优化,结果显示仅沙门菌菌株呈现特异性电泳条带,而志贺菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157∶H7、霍乱弧菌等其他5种肠道细菌均为阴性,特异性好;t HDA法检测沙门菌纯培养物的灵敏度为19cfu/μl,检测模拟样本的灵敏度为260 cfu/μl。采用t HDA方法检测18份真实样本,共检出9份沙门菌阳性,与国标法检测结果一致。结论沙门菌t HDA检测方法快速、灵敏、特异,在食源性疾病检测及监测中具有重要的技术优势。