中国科学家定向进化PET解聚酶推动废弃PET塑料完全降解

随着资源与环境问题的日益严峻,废弃塑料的有效回收与再利用已成为全球性研究热点。聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是目前应用较为广泛的一种合成塑料,PET的酶促解聚为废弃塑料的回收利用提供了一条绿色途径。IsPETase是近年来报道在常温下对PET水解活性最高的酶,但IsPETase的低稳定性限制了它的应用。

噬菌体PaP3多糖解聚酶对铜绿假单胞菌生物膜的作用研究

目的检测重组铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶对铜绿假单胞菌生物膜的降解活性。方法经FITC-ConA/PI荧光双染色后,采用激光扫描共聚焦显微镜观察重组多糖解聚酶处理前后PA3生物膜的形态变化,以测定多糖解聚酶对生物膜的降解活性;测定多糖解聚酶作用前、后铜绿假单胞菌对4种敏感抗生素(乳酸环丙沙星、加替沙星、头孢他啶、硫酸庆大霉素)的MIC、MBC变化情况,从而判断多糖解聚酶对抗生素的协同杀菌作用。结果FITC-ConA/PI荧光双染色结果显示,经重组多糖解聚酶处理后,铜绿假单胞菌生物膜的胞外多糖组分少而分散,包裹在胞外多糖组分里的细菌数量也大大减少,表明多糖解聚酶确实能够特异性的降解生物膜的胞外多糖组分。多糖解聚酶作用后四种抗生素相应的MIC、MBC都出现了不同程度的降低,其中以头孢他啶降低最为明显,表明多糖解聚酶对抗生素具有协同杀菌活性。结论重组噬菌体PaP3多糖解聚酶在体外可以特异性的降解铜绿假单胞菌生物膜的胞外多糖,有利于抗生素通透生物膜,作用于菌体,具有协同抗菌作用。

聚β-羟基丁酸酯解聚酶相关性质的研究

从不同环境和地域的活性污泥中分离筛选出 3种可降解聚 β 羟基丁酸酯 (PHB)的菌株 ,编号分别为DS970 1、DS971 0和DS971 3。对其所产生的PHB解聚酶的相关性质进行了研究。 3种菌株所产生的PHB解聚酶均是胞外酶 ,同时又都是诱导酶。不同菌株分泌PHB解聚酶的规律不同 ,但酶活力达到高峰的时间均为 96h。 3种粗酶液的表观最适反应温度均为 40℃～ 45℃ ,对粗酶液的最适反应pH也进行了表征。

聚β-羟基丁酸酯解聚酶的纯化及性质

对DS9701菌株产生的聚β-羟基丁酸酯(PHB)解聚酶进行了分离、纯化及有关性质的表征.通过SephadexG-100分离出两种PHB解聚酶(E1和E2),经聚丙烯酰胺凝胶电脉检测为一条谱带.E1的最适反应温度为40℃～45℃,稳定性优于E2,最适反应pH=4.0,稳定范围3.6～7.0,Km值为0.182g/L.E2的最适反应温度为40℃,pH=6.0,稳定范围4.0～8.0,Km值为0.65g/L.通过质谱仪测得E1的相对分子质量为4.5×104,E2的相对分子质量为4.4×104.

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因的克隆表达及生物学活性

目的:克隆表达铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因并检测其活性.方法:应用PCR技术从铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组中扩增多糖解聚酶基因,将其克隆于原核表达载体pQE-31中,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,IPTG诱导表达;采用Ni-NTA柱亲和层析分离纯化目的蛋白;提取铜绿假单胞菌生物膜胞外多糖,观察目的蛋白对胞外多糖的降解活性.结果:采用PCR技术成功扩增了铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因,所构建的重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致;转化E.coliJM109后,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约为20.4×103,与理论预期值一致;破菌后电泳证实目的蛋白主要在上清中以可溶形式表达.经Ni-NTA柱亲和层析后蛋白纯度大于95%.初步活性检测结果表明重组PaP3多糖解聚酶蛋白对生物膜胞外多糖具有一定的降解作用.结论:重组噬菌体PaP3多糖解聚酶在体外可以特异性的降解铜绿假单胞菌的胞外多糖,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.

紫外线诱变选育高产PHB解聚酶的菌株

以降解聚-β羟基丁酸酯(PHB)的青霉(Penicilliumsp.)DS9713a为出发菌株,通过紫外线(UV)诱变分生孢子,采用透明圈初筛和摇瓶复筛,获得酶活高于原始菌株的突变株5株,其中DS9713a-CS01突变株的PHB解聚酶活力高于对照97.42%,并对其酶学性质进行了初步研究。

聚β-羟基丁酸酯解聚酶的分离纯化及性质研究

研究了青霉Penicillium sp.DS9713a产聚β-羟基丁酸酯(PHB)解聚酶的情况,并通过超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀及Sepharose CL-6B凝胶色谱对PHB解聚酶进行了分离纯化,获得了解聚酶的纯酶组分,纯化倍数为59.1,回收率为20%。经检测该酶的分子量约为18000Da,等电点为7.6,化学试剂EDTA、SDS及巯基乙醇对酶活均有较强的抑制作用,而H2O2和尿素对酶活的抑制不明显;同时,对该纯酶组分的蛋白性质进行了测定,结果显示该酶天冬氨酸和谷氨酸含量较高,推测与底物结合作用相关,二级结构以α螺旋为主,不含β折叠;降解产物的质谱分析显示,该酶的作用产物为3HB单体,暗示其以外切模式对PHB进行降解。

P(3-co-4)HB解聚酶的分离纯化及酶学性质研究

聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P(3-co-4)HB)解聚酶是由微生物所分泌的一种胞外酶,可以将P(3-co-4)HB降解为水溶性小分子物质,为了阐明P(3-co-4)HB材料的生物降解机理并建立其生物循环系统,P(3-co-4)HB降解菌和降解酶的研究越来越受到关注。本论文以Penicillium sp.DS-04菌株为材料,对其产生的P(3-co-4)HB解聚酶进行了分离纯化,发酵液经过冻干和分子筛层析得到了P(3-co-4)HB解聚酶的纯酶组分,纯化倍数和回收率分别为3.15和10.44%,SDS-PAGE显示该酶分子量为44.0kDa。本文还对P(3-co-4)HB解聚酶的酶学性质进行了测定,并初步探讨了解聚酶的作用模式。

Penicillium sp.DS9701-09分泌的聚β-羟基丁酸酯(PHB)解聚酶的纯化及性质研究

以Penicillium sp.DS9701-09为研究对象,对其分泌的PHB解聚酶进行分离纯化和表征.通过超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-100凝胶过滤,从发酵液中纯化了一种对PHB具有高效降解能力的解聚酶,纯化倍数为37.9,酶活力回收率为8.9%.经SDS-PAGE检测,确定酶蛋白的相对分子质量为41.5 kDa.酶反应的最适温度和pH分别为50℃和5.0,在50℃以下和pH=5.0~6.0之间酶的稳定性较好.金属离子对PHB解聚酶具有一定的抑制作用,降解酶对PHB的酶解产物主要是羟基丁酸二聚体.

枯草杆菌NX-2聚谷氨酸解聚酶的克隆表达及其降解性质研究

利用PCR技术从γ-聚谷氨酸产生菌Bacillus subtilisNX-2的基因组DNA上扩增出聚谷氨酸内切解聚酶基因(ywtD),克隆后测序,对该基因编码区进行了序列分析,比对结果表明扩增的ywtD基因编码与文献报道的序列相似性为99.0%,碱基的差异均表现为碱基取代,仅有一个碱基取代导致编码氨基酸的变化,即第349位密码子由GCC变为GTC。将ywtD基因克隆入表达载体pET15b中,该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经0.5mmol/LIPTG诱导,外源解聚酶蛋白获得高效表达。利用酶的初提液对聚谷氨酸进行降解,结果显示经72小时解聚酶作用后,γ-PGA分子量从700kDa降到20kDa,此后随作用时间的延长,聚谷氨酸分子量趋于定值。

武夷山不同海拔梯度黄山松土壤有机氮解聚酶活性及其影响因素

土壤有机氮(SON)解聚酶对土壤大分子有机氮的解聚是土壤氮循环的限速步骤,对土壤氮循环至关重要。然而,目前亚热带森林中、高海拔梯度下SON解聚酶活性的动态及其影响因素尚不明确。在武夷山自然保护区海拔1200—2000 m的黄山松林,通过测定5个海拔梯度的土壤环境因子、理化性质和8种SON解聚酶活性的变化,探究了不同海拔梯度下SON解聚酶活性的分布规律及其影响因素。结果表明,除土壤DON含量外,其他测量的土壤环境因子和理化性质在不同海拔梯度下均存在显著的差异。SON解聚酶活性随海拔梯度呈现不同的分布规律:碱性蛋白酶(ALPT)、中性蛋白酶(NPT)、漆酶(Lac)和亮氨酸氨基肽酶(LAP)随海拔升高显著增加,酸性蛋白酶(ACPT)和几丁质酶(Chi)呈现先增后降的趋势,而锰过氧化物酶(Mnp)和谷氨酰胺酶(GLS)在海拔1800 m显著降低(P<0.05)。冗余分析表明,不同海拔梯度下SON解聚酶活性存在明显的聚类,土壤环境因子和理化性质对SON解聚酶活性的解释度高达88.18%。土壤温度(ST),含水率(SM),微生物生物量碳(MBC)和矿质氮(NH_(4)^(+),NO_(3)^(-))是不同海拔梯度下SON解聚酶活性变化的重要预测因子。相关分析表明,多数SON解聚酶活性与土壤ST呈显著负相关,与pH,SM,TN,MBC,NH_(4)^(+)和NO_(3)^(-)呈显著正相关。NH_(4)^(+)和NO_(3)^(-)含量动态随海拔梯度均呈现波浪式起伏变化,相比于上游的有机质底物,下游无机氮循环中的矿质氮对SON解聚酶活性产生更直接的影响。该研究有助于拓宽我们对亚热带森林中、高海拔土壤氮循环机理的认识,同时对土壤有效氮保持和生产力的维持具有重要意义。

噬菌体解聚酶及其与细菌荚膜间作用机制的研究进展

噬菌体疗法随着临床上耐药菌的种类与数量的增多而重新受到重视。细菌荚膜一方面是重要的毒力因子,另一方面也为噬菌体的识别和侵染宿主菌提供吸附位点。近年来研究表明部分噬菌体能产生降解细菌荚膜多糖的解聚酶,从而破坏细菌表面的保护结构,帮助噬菌体完成侵染,也利于血清或抗生素发挥作用。并且解聚酶具有化学性质和生物学效应稳定的特点,适合于大量生产。这为多重耐药菌感染的治疗提供了新的思路。本文将重点论述噬菌体解聚酶的结构与功能,并进一步阐述其与细菌荚膜间的作用机制,包括解聚酶的活性中心结构特征以及在荚膜上的作用位点等。

噬菌体多糖解聚酶及其应用

随着临床上广泛耐药菌株的检出率逐年升高,新型抗菌药物需求日益迫切。越来越多的研究者们将注意力集中到噬菌体治疗上,并在这个领域取得了较大的进展。大量的研究表明,一些噬菌体能够产生降解细菌胞外聚合物基质的多糖解聚酶,继而裂解并杀死宿主菌。该文综述了噬菌体多糖解聚酶的分类和作用方式,判断噬菌体是否产生解聚酶的方法,以及该酶在治疗细菌性感染、降解生物膜和细菌荚膜分型上的应用。

腐皮镰孢聚丁二酸丁二酯解聚酶基因优化及在毕赤酵母中的表达

聚丁二酸丁二酯是一种可替代传统塑料的生物降解塑料,有助于解决白色污染问题,但其在自然界中往往降解缓慢,获取高效降解微生物或解聚酶是使其快速有效降解的关键。通过构建重组毕赤酵母表达体系以实现腐皮镰孢聚丁二酸丁二酯解聚酶(FSC)的高效表达。根据毕赤酵母偏好密码子优化FSC的基因密码子,并导入毕赤酵母X33中实现其重组表达。进一步通过单因素实验优化了菌株的产酶条件。结果显示,优化后的FSC基因序列中的157个碱基发生改变,G+C含量由59.6%降低到48.3%,序列同源性为77.34%;构建的重组表达载体p PICZα-FSC转入毕赤酵母X33,结合抗性平板初筛、SDS-PAGE和Western bolt验证,以及摇瓶发酵酶活力测定获得了1株具有较高产酶能力的重组菌株L1;进一步确定其摇瓶发酵培养条件:培养基起始p H 6.0,摇床转速220 r/min,甲醇补加量1%,接种量8%,培养时间72 h,培养温度30℃,此优化条件下菌株发酵液酶活力可达110 U/mL。

短须嗜热单孢菌聚羟基脂肪酸酯解聚酶的表达、热稳定性改造及在PHB降解中的应用

聚羟基脂肪酸酯解聚酶(polyhydroxyalkanoate depolymerase,PHAD)可用于聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate,PHA)的降解回收,为开发热稳定性好的PHAD,本研究在大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中成功表达了来自短须嗜热单孢菌(Thermomonospora umbrina)的PHA解聚酶(TumPHAD),并通过二硫键理性设计获得了热稳定性提升的突变体A190C/V240C,其最适温度为60℃,比野生型提高20℃,50℃半衰期为7h,是野生型酶的21倍。将突变体A190C/V240C用于典型PHA之一的聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate,PHB)降解,在50℃条件下,PHB的2 h和12 h降解率较野生型分别提高了2.1倍和3.8倍。本研究获得的TumPHAD突变体A190C/V240C具有耐高温、热稳定性好和PHB降解能力强的特点,对PHB的降解回收具有重要意义。

大肠杆菌裂解性噬菌体生物学特性及其解聚酶活性验证

利用禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)从鸡粪中分离出1株裂解性噬菌体,测定噬菌体相关生物学特性,对噬菌体高通量测序、克隆、表达并纯化得到噬菌体来源解聚酶,通过苯酚硫酸法和联合血清杀菌验证解聚酶的活性。结果显示,该噬菌体感染宿主菌潜伏期小于5 min,感染25 min后达到平台期,噬菌体源性的解聚酶可以特异性降解宿主菌表面多糖,同时可以大幅度提高猴血清对宿主菌的杀灭作用。本试验一方面验证了噬菌体源性解聚酶的活性,另一方面给抗生素替代物提供了一个新的选择。

微管解聚酶MCAK的研究进展和展望

微管骨架是决定细胞可塑性与动力学的重要亚细胞结构,其动态性的高度可控是细胞健康的重要保证。在细胞内,微管动力学主要由微管相关蛋白调控。微管结合蛋白MCAK(mitotic centromere-associated kinesin)是细胞内主要的微管解聚酶之一,它通过调节纺锤体微管的动态性,保证有丝分裂中染色体的忠实分离。MCAK在有丝分裂中的活性受到多种激酶的严格调控。MCAK活性的异常与多种肿瘤的发生发展密切相关。

肺炎克雷伯菌噬菌体解聚酶的研究进展

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是在临床引起多种感染的常见条件致病菌之一。多重耐药肺炎克雷伯菌株的出现,给防控细菌感染带来了巨大阻力。肺炎克雷伯菌噬菌体编码的解聚酶是一种稳定性高、特异性强的生物酶,具有分解细菌胞外多糖、限制细菌生长等多种功能。解聚酶可为防控肺炎克雷伯菌感染提供新思路,在抗菌应用中具有广阔前景。本文就肺炎克雷伯菌噬菌体解聚酶的研究进展进行综述。

噬菌体解聚酶的分类与结构特征及其应用研究进展

噬菌体解聚酶(depolymerase)是一种可特异性降解细菌表面多糖的噬菌体蛋白。自该蛋白于1956年被首次报道以来,相关学者不断对其功能进行挖掘和探索。现已证实该蛋白具有快速鉴定微生物荚膜类型、清除并抑制生物被膜(biofilm)、降低细菌毒力等功能,在控制病原细菌感染等公共卫生领域具有重要的应用价值。现主要围绕噬菌体解聚酶的分类学特征、结构生物学特性以及相关应用研究进展进行综述。