外源底物亚油酸对解脂耶氏酵母重组菌株合成共轭亚油酸的影响

为了提高解脂耶氏酵母重组菌株的反-10,顺-12-共轭亚油酸(t10,c12-CLA)产量,采用YNBDL培养基进行摇瓶发酵,考察了在培养基中添加不同纯度的亚油酸对解脂耶氏酵母合成t10,c12-CLA的影响。结果表明:亚油酸纯度的提高对菌株的生长和产脂未产生影响,且t10,c12-CLA的产量随亚油酸纯度的增加而提高,最高产量可达3.7 g/L;用大豆油替代培养基中的亚油酸,t10,c12-CLA的转化率从20%提高至25%,菌株生长、产脂及t10,c12-CLA产量与添加纯度为65%亚油酸的结果相近。实验证明解脂耶氏酵母重组菌株能够高效转化富含亚油酸的植物油合成t10,c12-CLA。

解脂耶氏酵母菌处理含油废水的研究

利用解脂耶氏酵母菌在最佳降解条件下分别处理色拉油、餐饮油等油脂类废水和柴油、机油等石油类废水50h．结果表明：该菌株能快速降解油脂，在油质量浓度≤2000mg／L时生化反应属于一级反应，对色拉油、餐饮油中油脂的降解率分别为93．30％和85．08％，同时菌体细胞大量生长，其生物量分别为1652．7和1940．0mg／L，废水处理过程中pH稳定在3—4之间；但该菌对石油的降解率低，生成的生物量少，处理后废水pH维持在6～7之间．解脂耶氏酵母菌对油的降解与自身生物量的生成有关，该菌株降解油脂类和石油类物质的途径不同，产生的脂酶系统不同，使得废水的pH变化规律不相同．

牦牛胃溶菌酶在解脂耶氏酵母中的重组表达及性质研究

研究牦牛胃溶菌酶基因(yak stomach lysozyme gene, ys LYZ)在解脂耶氏酵母中的异源表达、分离纯化及抗菌机制。通过人工合成构建p INA1297-ys LYZ,转化至宿主解脂耶氏酵母(Polh)菌株,分别培养24、48、72 h及96 h。发酵上清液经纯化后得到重组牦牛胃溶菌酶(recombinant yakstomach lysozyme, rys LYZ)。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate poly-acrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)检测rys LYZ的分子量,用检测试剂盒测定其比活,通过电镜观测其对金黄色葡萄球菌的作用,并对rys LYZ在模拟猪胃液中的降解情况进行了观察。结果表明:rys LYZ的分子量为15 k Da,其表达量在培养72 h时最高,纯化后比活为1 855.42 U/mg。电镜下观察到rys LYZ作用金黄色葡萄球菌后,菌体出现孔洞,最终崩解。在模拟猪胃液中,rys LYZ可在胃蛋白酶作用4 h后仍保持部分完整,表明其具有优良的抗胃蛋白酶能力。本研究得到的rys LYZ能够在酸性环境中保持高酶活,主要通过破坏细菌胞壁发挥抑菌作用,并能有效抵抗胃蛋白酶的降解。

含油酸培养基培养对重组解脂耶氏酵母全细胞催化合成反10,顺12-共轭亚油酸的影响

亚油酸异构酶(PAI)在解脂耶氏酵母细胞内成功表达,以添加外源c9,c12-亚油酸(c9,c12-LA)为底物,全细胞催化合成反10,顺12-共轭亚油酸(trans10,cis12-conjugated linoleic acid,t10,c12-CLA)。解脂耶氏酵母在分别含0.0(对照组)、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/L油酸的培养基中生长,收集菌体转移至磷酸盐缓液中进行全细胞催化,比较各组菌体的t10,c12-CLA产率,含5.0 g/L油酸组产物产率最高,达到1.34 g/g,是不含油酸组的1.4倍左右。通过PAI酶活分析及Western blot检测PAI表达量,结果表明,培养基中油酸含量越高,重组解脂耶氏酵母的PAI表达量越低;对比不含油酸组和含5.0 g/L油酸组全细胞催化不同时间的t10,c12-CLA产量,含5.0 g/L油酸组t10,c12-CLA产量最高点的时间比不含油酸组提前约20 h;透射电子显微镜观察2组的菌体状态,含5.0 g/L油酸组细胞壁和细胞膜间隙扩大,该变化可能增加了全细胞催化过程中底物和产物进出细胞的速率,从而提高t10,c12-CLA的转化效率。

解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2与疏水蛋白SC3融合表达及催化性质

为研究疏水蛋白融合表达对脂肪酶的催化性质影响,分别构建分泌表达解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2,带His标签Lip2及Lip2与疏水蛋白SC3融合蛋白的重组质粒PKL、PKHL和PKHLS并分别转化到毕赤酵母GS115菌株中,通过筛选,获得表达活性较高的工程菌株(KL、KHL、KHLS)。对3株重组菌株的培养与重组蛋白催化性质研究表明蛋白相对分子质量为36 k Da、36 k Da、46 k Da,发酵液对底物对硝基苯酚辛酸酯(p-NPC)水解酶活分别达到5.35、4.69、2.4 U/m L。最适温度均是45℃,最适p H均是7.5,另外KHLS菌株的酶活力受表面活性剂的影响比KL和KHL小。

高效猪毛角蛋白降解菌株的分离与鉴定

为了筛选能高效降解猪毛角蛋白的微生物,从长期堆放废弃猪毛的土壤中取样,采用以猪毛粉为唯一碳氮源的培养基分离角蛋白降解菌,并对其产角蛋白酶条件进行了研究。通过驯化培养后,筛选到5株能够降解猪毛角蛋白的菌株,其中菌株E-2降解效果最佳。将E-2接种到以猪毛为唯一碳氮源的培养基中培养5 d后,猪毛降解率达58.6%,发酵液中角蛋白酶活为46.6 U·m L^(-1)。结合形态学观察、生理生化特征及ITS序列分析,鉴定该菌株为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。E-2产酶影响条件实验结果表明,培养108 h后酶活性最高,产角蛋白酶最适条件为p H值6.0~7.0,温度35~40℃,猪毛粉添加量15 g·L^(-1)。E-2能降解猪毛、鸡毛、羊毛,但降解活性及产酶活性均不同。该菌株的分离筛选为微生物降解猪毛角蛋白提供了新的菌种资源,至今未见解脂耶氏酵母在降解毛发角蛋白方面的相关报道。

代谢工程构建重组耶氏解脂酵母生产中长链聚羟基脂肪酸酯

中长链聚羟基脂肪酸酯(mcl-PHA)是一大类由微生物合成的天然生物聚酯,因具有可再生性和生物降解性越来越受到人们的关注。Mcl-PHA可由一些假单胞菌类利用自身的脂肪酸合成途径或β-氧化途径来合成。耶氏解脂酵母具有很好的脂/脂肪酸分解代谢能力,但是它体内缺乏PHA合成酶不能合成mcl-PHA。采用代谢工程策略构建重组解脂酵母,外源表达来自铜绿假单胞菌PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1)的PHA合成酶。在PHA合成酶的C端添加PTS1过氧化物酶体定位信号序列,使其在过氧化物酶体内发挥功能,并对其编码基因Pha C1进行密码子优化得到o Pha C1。利用p INA1312载体构建表达框,借助载体上的zeta序列元件将o Pha C1基因表达框整合至酵母基因组,完成基因的稳定表达。重组菌PSOC在葡萄糖为唯一碳源的培养基中几乎不产PHA,添加0.5%的油酸时可合成占细胞干重0.67%的mcl-PHA。在含三油酸甘油酯的培养基中发酵72h产生1.51%mcl-PHA(wt%)。实验结果充分证明重组解脂酵母作为有潜力的微生物细胞工厂可以用于生产mcl-PHA,也为将来利用富含油脂和其他营养的餐厨垃圾水解液等廉价资源生产mcl-PHA打下基础。

重组解脂耶氏酵母生产谷氨酰胺转胺酶酶原的发酵优化

谷氨酰胺转胺酶(EC2.3.2.13,TGase)是一种重要的食品酶,广泛应用于食品组分的质构、起泡性及乳化性等功能性质的改善。以一株分泌谷氨酰胺转胺酶酶原(pro-TGase)的重组解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica BBETG为研究对象,结合单因素实验与正交实验对其发酵培养基进行优化,以期实现pro-TGase的高产。结果表明,较优的发酵培养基配方为:甘油15 g/L、酵母膏20 g/L、氯化铵2.64 g/L、KH2PO4 0.32 g/L、无水MgSO4 0.25 g/L、VB13.34×10-4 g/L,初始pH值8.0。在该培养基中,重组菌于28℃发酵120 h,获得的pro-TGase经体外活化,酶活达8.47 U/mL,较初始发酵培养基产量提高393%。

食品安全菌生产蔗糖异构酶的研究进展

分析蔗糖异构酶的来源、结构和反应机理,综述近十年利用食品安全菌株异源表达蔗糖异构酶的研究进展以及现阶段生产蔗糖异构酶的优化策略。最后,对蔗糖异构酶的研究进展进行总结,指出当下蔗糖异构酶研究的不足,并从表达宿主菌株改造和蔗糖异构酶编码基因改造两个方面展望其今后的研究方向,为利用食品安全菌株生产异麦芽酮糖提供理论依据。

毕赤酵母中表达透明颤菌血红蛋白提高重组脂肪酶的表达

解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2(YlLip2)是一种具有广泛应用前景的工业酶。为了改善高密度发酵生产YlLip2过程中的溶氧限制,提高YlLip2的表达量,将YlLip2基因lip2和透明颤菌血红蛋白(VHb)基因vgb分别置于AOX1启动子和PsADH2启动子的调控之下,进行YlLip2和VHb在毕赤酵母中的共表达。PsADH2启动子来源于树干毕赤酵母Pichia stipitis,在低氧条件下能被激活。SDS-PAGE和CO-差式光谱分析表明,YlLip2和VHb在重组菌中成功实现了共表达。在氧限制性条件下,VHb表达的细胞(VHb+,GS115/9Klip2-pZPVT)与对照细胞(VHb?,GS115/9Klip2)相比,摇瓶和10 L发酵罐中YlLip2表达量分别提高了25%和83%。此外,在低氧条件下,VHb+细胞在10 L发酵罐中的生物量也比VHb?细胞高。文中也获得了一株表达了VHb的并携带有多个lip2基因拷贝的克隆子GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#,在低氧条件下,该克隆子在10 L发酵罐中的最高脂肪酶水解活力达33 900 U/mL。因此,在毕赤酵母中用PsADH2启动子表达VHb,同时增加lip2基因的拷贝数是提高YlLip2表达量的一种有效策略。