基于TLR7-MyD88-IRAK4信号通路的解表清里方体内抗甲型流感病毒的实验研究

目的:探讨中药复方解表清里方体内抑制甲型H1N1流感病毒株复制的作用及机制。方法:使用随机数字法,将132只SPF级小鼠平均分为空白组、模型组、磷酸奥司他韦组(剂量为0.0375 g/kg)、解表清里方高、中、低剂量组(剂量分别为6.05、3.02和1.51 g/kg),每组22只。空白组不进行任何操作,用甲型流感病毒[A/Brisbane/02/2018(H1N1),pdm09-like virus(H1N1)]滴鼻法感染其他组小鼠,在造模2 h后,空白组和模型组用生理盐水灌胃,其他组给予相应剂量的药物,各组灌胃7 d。给药期间每日定期检测小鼠体质量及活动状态,在造模第3天和第7天取材,检测小鼠肺指数和肺部病理改变;qPCR法检测肺组织中病毒核酸载量;蛋白质印迹法检测造模第7天小鼠肺组织中TLR7、MyD88和IRAK4蛋白表达水平。结果:解表清里方可以减轻全身症状,降低肺指数,延缓小鼠体质量下降(P<0.05,P<0.01),改善肺组织病理损伤,降低鼠肺病毒滴度(P<0.01),上调肺组织中TLR7、MyD88和IRAK4蛋白表达量(P<0.05,P<0.01),其中解表清里方高剂量组的疗效最优。结论:解表清里方可剂量依赖性改善小鼠肺部感染、降低病毒复制,其机制可能与TLR7-MyD88-IRAK4信号通路有关。

解表清里方干预甲型H1N1流行性感冒小鼠的抗病毒作用机制

目的:探讨解表清里方对甲型H1N1流行性感冒小鼠的抗病毒作用机制。方法:用随机数字法将36只7周龄雌性BalB/c小鼠随机分为空白组、模型组、西药组及解表清里方高剂量组、中剂量组、低剂量组,每组6只。空白组给予等量生理盐水滴鼻,其余组小鼠给予甲型流感病毒液于左侧鼻孔滴鼻,每只50μL。造模2 h后,西药组给予0.037 5 g/(kg·d)磷酸奥司他韦灌胃;解表清里方高剂量组、中剂量组、低剂量组分别给予6.05 g/(kg·d)、3.02 g/(kg·d)、1.51 g/(kg·d)解表清里方灌胃。空白组及模型组同时给予生理盐水0.2 mL灌胃,均1次/d,连续5 d。对比各组肺指数、胸腺指数和脾脏指数,肺组织病理变化,肺组织中乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达,肺悬液中病毒基因及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)mRNA表达,肺组织中PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表达。结果:动物实验结果显示,与模型组相比,西药组和中药高剂量组能降低小鼠肺指数(P<0.05),其他组别能降低肺指数、升高胸腺指数和脾脏指数,但差异无统计学意义(P>0.05);解表清里方高、中剂量组能减轻小鼠肺部病变程度,西药组、解表清里方高、中剂量组能降低小鼠肺组织中M、NS2病毒基因复制水平(P<0.01或P<0.05);西药组和解表清里方高剂量组能降低小鼠肺组织中mTOR表达水平;西药组、解表清里方高剂量和中剂量组均能显著下调PI3K、AKT和GSK-3β蛋白和mRNA的表达水平(P<0.01或P<0.05)解表清里方低剂量组在各个方面与模型组相差不显著。结论:解表清里方甲型H1N1流感小鼠有抗病毒作用,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT/GSK-3β信号通路中关键蛋白PI3K、AKT、GSK-3β、mTOR表达有关。

流感病毒性肺炎小鼠肺组织炎性细胞因子表达及疏风宣肺方和解表清里方的调控作用

目的研究流感病毒性肺炎小鼠肺组织炎性细胞因子表达及疏风宣肺方和解表清里方的调控作用。方法制备甲型流感病毒性肺炎小鼠模型,随机分为空白组、肺炎模型组、奥司他韦对照组、疏风宣肺方大、中、小剂量组(SL、SM和SS),解表清里方大、中、小剂量组(JL、JM和JS)。提取总RNA,采用基因芯片Pathway分析,挑选参与调控炎症相关通路中的靶基因。同时,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对IL-1β、IL-8、IL-10、CCL5(RANTES)、ICAM-1的mRNA表达水平进行验证。采用Western blot法对肺组织IL-1β的表达进行验证。结果模型组差异表达基因IL-1β、CXCR2、CCL5、IL-10、IL-6、IL-18、TGF-β1、CCL2明显上调,较正常组差异显著。各剂量治疗组对IL-1β、CXCR2、IL-10、IL-6表达有显著的下调作用,SM及SS组下调IL-18、TGF-β1、CCL2、CCL5基因的表达,JM及JL组下调差异表达基因IL-18、CCL5。qRT-PCR和Western blot法结果显示,两种方药各剂量组均可降低IL-1β的mRNA与蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。SM组和JM组对IL-8、IL-10、RANTES、ICAM-1的mRNA有显著抑制(P<0.05或P<0.01)。qRT-PCR结果与基因芯片结果基本一致。结论疏风宣肺方和解表清里方均可抑制流感病毒感染后肺组织的免疫炎症损伤。

疏风宣肺方和解表清里方干预流感病毒性肺炎小鼠细胞凋亡的研究

目的病毒感染宿主细胞后,细胞凋亡天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白(caspase)途径激活限制病毒复制,但甲型流感病毒感染引起的细胞凋亡的分子机制尚不完全清楚。探讨流感病毒性肺炎小鼠肺组织细胞凋亡相关的基因及2种不同抗流感病毒方药的治疗作用。方法制备甲型流感病毒性肺炎小鼠模型,随机分为空白组、肺炎模型组、奥司他韦对照组、疏风宣肺方高、中、低剂量组,解表清里方高、中、低剂量组。提取各组小鼠肺组织总RNA,采用基因组芯片筛选出与凋亡密切相关的差异表达基因,并用荧光定量PCR对天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白基因进行验证。结果肺炎模型组肺组织中差异表达基因casp-3、casp-8、casp-9、Fas、FasL、TNF、TNFrasf1a、Tradd、IL1a、IL1b、IL1r1、IL1r2、casp-7明显上调,与空白组比较差异有统计学意义。疏风宣肺方中剂量组差异表达基因casp-8、casp-7、Fas、FasL、TNF、TNFrasf1a、Tradd、IL1a、IL1b、IL1r1、IL1r2明显下调。疏风宣肺方低剂量组下调上述基因的作用强于解表清里方低剂量组,疏风宣肺方中剂量组治疗效果优于解表清里方中剂量组。疏风宣肺方低剂量组与解表清里方中剂量组对casp-3、-8、-9表达有显著抑制,差异有统计学意义(P<0.01)。不同剂量疏风宣肺方的治疗效果与解表清里方比较如下:疏风宣肺方低剂量组>疏风宣肺方中剂量组>解表清里方中剂量组>解表清里方低剂量组。结论疏风宣肺方对细胞凋亡调控基因的调控作用强于解表清里方,上调casp-3、-8、-9表达,对抗流感病毒感染后的细胞凋亡较强,对甲型流感病毒性肺炎小鼠治疗作用优于解表清里方。

疏风宣肺方和解表清里方对流感病毒H1N1感染人肺腺癌上皮细胞A549中TLR3/7信号通路作用的研究

目的:研究疏风宣肺方和解表清里方体外对人肺腺癌上皮细胞A549中TLR3/7信号通路的影响。方法:利用基因芯片技术研究甲型流感病毒H1N1感染A549细胞后TLR3/7信号通路中基因转录的变化。采用荧光定量PCR和Western blotting法检测各组细胞中的Toll样受体3(Toll-like receptor3,TLR3)、Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,My D88)、激活核因子Kappa B(nuclear factor-Kappa B,NF-κB)的mRNA及蛋白表达的变化。结果:在TLR3/7相关信号传导通路中,与细胞对照组相比,H1N1感染组差异表达基因Tlr3、Tlr7、Myd88、Nfbk1、Mapk8、Mapk13、Ifna1、Ifnβ1明显上调,奥司他韦组、疏风宣肺组和解表清里组对差异表达基因Tlr3、Tlr7、Myd88、Nfbk1、Mapk8、Mapk13、Ifna1、Ifnβ1明显下调。qRT-PCR结果显示,与细胞对照组比较,H1N1感染组TLR3/7、My D88、NF-κB的mRNA表达均显著升高(P<0.01)。与H1N1感染组比较,疏风宣肺组的TLR3/7、My D88、NF-κB的mRNA表达均明显降低(P<0.05或P<0.01),解表清里方对TLR3/7、NF-κB的mRNA表达均明显降低(P<0.05或P<0.01)。同时,疏风宣肺组治疗效果优于解表清里组。Western blotting结果显示,H1N1感染组TLR3/7、NF-κB蛋白较正常组显著升高(P<0.05)。与H1N1感染组比较,两种方药的TLR3/7、NF-κB表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:疏风宣肺方和解表清里方可以抑制流感病毒H1N1所诱导的TLR3/7信号通路活化,下调活性NF-κB的转录活性,发挥抗流感病毒的作用。

疏风宣肺方、解表清里方药对流感病毒小鼠TLR7、MyD88、NF-κB mRNA及蛋白表达的影响

目的观察疏风宣肺和解表清里方药对流感病毒亚甲型肺适应株(FM1)感染小鼠肺组织细胞Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、激活核因子Kappa B(nuclear factor-kappaB,NF-κB)mRNA及蛋白表达的影响。方法选择108只小鼠,随机分为9组:正常组,模型组,磷酸奥司他韦胶囊组[西药组,2.5g/(mL·d)],疏风宣肺方(中药1)高、中、低剂量组[3.762、1.881、0.941g/(kg·d)],解表清里方(中药2)高、中、低剂量组[4.368、2.184、1.092g/(kg·d)],每组12只。将各组小鼠用乙醚轻度麻醉,正常组以0.05mL生理盐水滴鼻,其余各组以0.05mL4LD50流感病毒FM1稀释液滴鼻感染小鼠。造模成功率100%。感染后2h灌胃给药。正常组、模型组灌胃蒸馏水,0.2mL/次,1次/d,连续干预4天。采用RT-PCR反应测定肺组织TLR7、MyD88、NF-κB mRNA表达,采用Western blot法测定肺组织TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表达水平。结果与正常组比较,模型组TLR7、MyD88、NF-κB mRNA表达升高(P<0.01);与模型组比较,西药组,中药1高、中、低剂量组TLR7、MyD88、NF-κB mRNA及蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),中药2高、中剂量组TLR7、NF-κB mRNA及蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),中药2高、中剂量组MyD88mRNA表达降低(P<0.05),中药2中剂量组MyD88蛋白表达降低(P<0.05),中药2低剂量组TLR7、NF-κB蛋白表达降低(P<0.05)。与西药组比较,中药1低剂量组MyD88蛋白表达降低(P<0.05),中药1中、低剂量组NF-κB蛋白表达降低(P<0.01);中药2高、中、低剂量组TLR7mRNA及蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),MyD88蛋白表达降低(P<0.01),中药2低剂量组NF-κB mRNA及蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论疏风宣肺方各剂量和解表清里中剂量能通过调节MyD88依赖的TLR信号传导通路下调NF-κB活性,发挥抗流感病毒的作用。疏风宣肺方效果优于解表清里方。

疏风宣肺方与解表清里方对流感病毒H_1N_1感染的A549细胞凋亡的影响

目的:探讨疏风宣肺方与解表清里方对流感病毒H1N1感染的A549细胞凋亡的影响。方法:培养人肺腺癌上皮细胞A549,甲型流感病毒H1N1感染A549细胞后,以达菲为药物对照组,利用基因芯片技术通过KEGG pat hway分析涉及细胞凋亡信号传导途径。研究疏风宣肺方与解表清里方凋亡信号通路中基因转录的变化;同时采用荧光定量PCR检测各组细胞中的肿瘤坏死因子受体超家族成员6(Fas)、Fas配体(Fas L)及天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白-3、-8、-9(Caspase-3、-8、-9)m RNA表达的变化;West er n bl ot t i ng法检测各组细胞中蛋白的变化。结果:与细胞对照组相比,H1N1感染组差异表达基因Casp3、Casp8、Casp9、Fas、Fasl明显上调,奥司他韦组、疏风宣肺组和解表清里组对差异表达基因Casp8、Casp7、Fas、Fasl明显下调;q RT-PCR结果显示,与细胞对照组比较,H1N1感染组Caspase-3、-8、-9、Fas、Fas L的m RNA表达均显著升高(P<0.01);与H1N1感染组比较,疏风宣肺组Caspase-3、-8、-9、Fas、Fas L的m RNA表达均明显降低(P<0.05),解表清里组Caspas e-3、-9、Fas、Fas L的m RNA表达均明显降低(P<0.05)。同时疏风宣肺组治疗效果优于解表清里组。Wes t er n bl ot t i ng结果显示,H1N1感染组Fas、Fas L蛋白细胞较对照组显著升高(P<0.05)。与H1N1感染组比较,2种方药的Fas、Fas L表达均显著降低(P<0.05);q RT-PCR结果与基因芯片结果基本一致。结论:疏风宣肺方与解表清里方均可调控甲型流感病毒感染后的Caspase-3、-8、-9、Fas、Fas L表达,可对抗流感病毒感染后的细胞凋亡。

疏风宣肺及解表清里方药对流感病毒感染小鼠肺损伤的保护研究

目的:观察疏风宣肺抗流感方和解表清里抗流感方对流感病毒亚甲型肺适应株(FM1)小鼠病毒性肺炎的治疗作用。方法:流感病毒肺适应株FM1滴鼻感染小鼠,建立小鼠流感病毒性肺炎模型,于病毒感染后2h,对照组、模型组灌服蒸馏水;达菲组给达菲2.5g.mL-1.d-1;其余6组分别灌服疏风宣肺抗流感方药高、中、低剂量(3.762、1.881、0.941g.kg-1.d-1)和解表清里抗流感方药高、中、低剂量(4.368、2.184、1.092 g.kg-1.d-1);均每日1次,每次0.2mL,连用4d。用高、中、低剂量的两种方药灌胃治疗后,观察小鼠的肺指数、肺组织切片病理形态变化。结果:疏风宣肺抗流感方和解表清里抗流感方中、低剂量组能较明显地降低肺指数,与模型组比较有统计学差异(P<0.05),能减轻肺组织病变。结论:疏风宣肺抗流感方和解表清里抗流感方能改善流感病毒感染小鼠的肺组织病理损伤,有抗流感病毒的作用。

疏风宣肺和解表清里方药对流感病毒性肺炎小鼠Toll样受体通路影响的研究

目的 观察疏风宣肺、解表清里方对流感病毒亚甲型肺适应株FM1感染小鼠肺组织细胞Toll样受体（TLR）信号转导通路的影响.方法 制备小鼠甲型流感病毒性肺炎模型,按随机数字表法分为对照组（C）,模型组（M）,达菲组（D）,疏风宣肺方高、中、低剂量组（SH、SM、SL）,解表清里方高、中、低剂量组（JH、JM、JL）,每组12只.制模后2h,对照组、模型组均灌胃蒸馏水,达菲组灌胃达菲2.5 g·mL^-1·d^-1,不同剂量方药组分别灌胃疏风宣肺方颗粒剂3.76、1.88、0.94 g·kg^-1·d^-1和解表清里方颗粒剂4.37、2.18、1.09 g·kg^-1·d^-1,各组均0.2 mL/d,连用4d.提取肺组织总RNA,采用基因组芯片筛选出与TLR通路相关的差异表达基因,并用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）对部分基因进行验证.结果 与对照组比较,模型组差异表达基因TLR7、MYD88、CCL5、IFNB1、IL6、IL12a、NFKBIA、IKBKB明显上调.与模型组比较,疏风宣肺方中、低剂量组和解表清里方中剂量组差异表达基因TLR3、TLR7、MYD88、CCL5、IFNB1、IL6、IL12a、NFKBIA、IKBKB明显下调[疏风宣肺方中剂量组log2（SM组/M组信号强度）分别为-1.24、-2.02、-1.36、-1.95、-0.63、-1.33、-3.50、-1.33、-1.33,疏风宣肺方低剂量组log2（SL组/M组信号强度）分别为-1.07、-2.43、-2.63、-2.30、-5.09、-3.19、-3.53、-1.95、-1.95;解表清里方中剂量组log2（JM组/M组信号强度）分别为-1.78、-0.55、-1.35、-1.47、-1.65、-2.03、-3.02、-1.57、-1.57],提示疏风宣肺方治疗效果比解表清里方好.RT-PCR结果显示,与模型组比较,疏风宣肺方高、中、低剂量组和解表清里方高、中剂量组及达菲组对TLR7、核转录因子-KB（NF-κB）、髓样分化抗原88（MyD88）的mRNA表达均有抑制作用,其中疏风宣肺方中、低剂量组（TLR7 mRNA：3.6±0.3、3.5±1.2比7.4±1.6; NF-κBmRNA：1.1±0.2、1.0±0.2比2.2±0.4;MyD88 mRNA：1.4±0.4、1.0±0.3比3.4±0.9,均P＜0.01）和解表清里方中剂量组（TLR7 mRNA：4.9±0.3比7.4± 1.6; NF-κB mRNA：1.3 ±0.7比2.2±0.4; MyD88mRNA：1.6±0.8比3.4±0.9,P＜0.05或P＜0.01）作用较为明显.结论 中、低剂量疏风宣肺方和中剂量解表清里方通过调控MyD88依赖的TLR信号转导通路下调NF-κB表达,从而治疗流感;疏风宣肺方药疗效较好.

疏风宣肺方及解表清里方对流感病毒性肺炎小鼠肺组织中TLR3、P38、JNK表达的影响

目的:研究流感病毒性肺炎小鼠肺组织Toll样受体Ⅲ(TLR3)、促分裂原活化蛋白激酶13(P38)、促分裂原活化蛋白激酶8(JNK)表达及疏风宣肺方和解表清里方的调控作用。方法:制备甲型流感病毒性肺炎小鼠模型,随机分为空白组、肺炎模型组、奥司他韦对照组、疏风宣肺方大、中、小剂量组,解表清里方大、中、小剂量组。提取总RNA,采用基因芯片Pathway分析,挑选参与MAPK信号传导通路相关的靶基因。同时,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot技术在mRNA和蛋白表达水平对TLR3、P38、JNK的表达进行验证。结果:肺炎模型组差异表达基因Tlr3、Mapk8、Mapk13明显上调,较空白组差异显著。疏风宣肺方中小剂量和解表清里中剂量组对差异表达基因Tlr3、Mapk8、Mapk13表达有显著的下调作用。qRT-PCR和Western blot法结果显示,肺炎模型组TLR3、JNK、P38的mRNA和蛋白表达较空白组显著升高(P<0.05,P<0.01)。疏风宣肺方中、小剂量组和解表清里方中剂量组对TLR3、JNK、P38的mRNA和蛋白有显著抑制(P<0.05,P<0.01)。且疏风宣肺方的治疗作用存在量效关系,剂量越小,疗效越好。其治疗效果比较如下:疏风宣肺方小剂量组>解表清里方中剂量组>疏风宣肺方中剂量组>解表清里方小剂量组。该结果和基因芯片表达的结果相符。结论:疏风宣肺方和解表清里方可能通过抑制以TLR3介导MAPK信号通路中JNK和P38过度活化来拮抗肺组织炎症损伤和细胞凋亡,从而发挥抗病毒作用。

流感病毒性肺炎小鼠自然杀伤细胞毒性相关信号转导通路差异基因表达及两种不同治法中药方剂的调控作用研究

目的观察疏风宣肺方和解表清里方对流感病毒性肺炎小鼠自然杀伤细胞（NK细胞）毒性相关信号转导通路差异基因表达的调控作用。方法将90只ICR小鼠按随机数字表法分为对照（N）组、模型（M）组、奥司他韦（C）组以及中药疏风宣肺方高、中、低剂量（SH、SM、SL）组和解表清里方高、中、低剂量（JH、JM、JL）组，每组10只。采用流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1滴鼻感染方法制备流感病毒性肺炎模型；N组以0．05m1等渗盐水滴鼻。于制模后2h，C组给予奥司他韦11．375mg·kg-1·d-1灌胃；SH、SM、SL组给予疏风宣肺方（主要药物金银花、连翘、板蓝根等）3．76、1．88、0．94g.kg-1·d-1灌胃；JH、JM、JL组给予解表清里方（主要药物麻黄、石膏、生甘草等）4．36、2．18、1．09g·kg-1.d-1灌胃；N组及M组则灌胃等量生理盐水；各组均0．2mud，连用4d。提取肺组织总RNA，采用基因芯片筛选出NK细胞毒性信号转导通路相关的差异表达基因，以I表示信号强度；并采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白质免疫印迹试验（Weslernblotting）对部分基因进行验证。结果在NK细胞毒性相关信号转导通路中，M组较N组上调差异基因43个。用药治疗后，SM组下调差异表达基因36个，JM组下调差异表达基因29个，SL组下调差异表达基因22个，JH组下调差异表达基因21个，SH组下调差异表达基因20个，儿组下调差异表达基因10个；SH、SL、JH、JM、JI组表达下调的基因均包括在SM组的表达谱中，表明中剂量疏风宣肺方调控NK细胞毒性作用最显著。荧光定量PCR和Westernblotting测定结果显示，与M组比较，疏风宣肺方与解表清里方各剂量组对肿瘤坏死因子-α（TNF—α）的mRNA及蛋白表达均有显著抑制作用，疏风宣肺方和解表清里方均以中剂量组最低（TNF—αmRNA：1．07±0．19、1．19±0．14比3．20±0．56，均P〈0．01）。结论流感病毒感染后在宿主细胞内增殖即成为带有病毒抗原的靶细胞，并激活NK细胞毒性信号转导通路的相关基因表达增加，被NK细胞识别并杀伤；两种方药可下调NK细胞中表达上调的差异基因，下调机制与其能明确减少流感病毒性肺炎体内靶抗原、减弱NK细胞识别活化作用有关。

不同治法方药对流感病毒性肺炎小鼠MMPs和TIMPs表达影响的研究

目的:探讨不同治法方药对流感病毒性肺炎小鼠基质金属蛋白酶(MMPs)和基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)表达的作用。方法:制备小鼠甲型流感病毒性肺炎模型,随机分为正常组(N),模型组(M),达菲组(C),疏风宣肺方大、中、小剂量组(SL、SM和SS),解表清里方大、中、小剂量组(JL、JM和JS)。采用基因芯片筛选MMPs和TIMPs的差异基因;荧光定量PCR对部分差异基因进行验证。结果:与N组相比,M组差异基因MMP-9、TIMP-1、MMP-3、MMP-14、MMP-19明显上调及MMP-2、TIMP-2明显下调。与M组相比,SM、SS和JM组对MMP-9、MMP-3、MMP-14、MMP-19基因具有显著的下调作用,显著上调TIMP-2的基因表达;荧光定量PCR显示,SM、SS和JM、JS组对MMP-9、MMP-1表达有显著抑制(P<0.05,P<0.01)。结论:疏风宣肺方调节甲型流感病毒性肺炎小鼠MMPs和TIMPs表达,抑制流感病毒感染后的肺组织炎症损伤,且治疗作用优于解表清里方。