成年小鼠触液神经元体外分离培养及自我更新能力的鉴定

背景:课题组前期成功在体外分离培养乳鼠触液神经元,尚无研究报道有效分离培养高纯度成年小鼠触液神经元的方法,且触液神经元的自我更新能力是否随着年龄发生变化尚无研究。目的:建立一种高纯度成年小鼠触液神经元体外分离培养的方法,并鉴定成年小鼠触液神经元与乳鼠触液神经元在体外的自我更新能力。方法:从成年3月龄小鼠颈髓分离含有触液神经元的原代细胞贴壁培养并利用融合多模态成像基因的慢病毒转染细胞,通过嘌呤霉素筛选得到高纯度成年小鼠触液神经元细胞,在完全培养基中悬浮培养。通过免疫荧光检测成年小鼠触液神经元表达神经干细胞标记物巢蛋白(Nestin)及SOX2情况,观察成年小鼠触液神经元体外成球与传代能力;将同等数量(5×10^(3))的第3代成年小鼠及乳鼠触液神经元在同等条件下分为2组,分别接种在含有完全培养基的超低黏附培养板中,在体积分数5%CO_(2),37℃恒温箱悬浮培养,通过体外成球、CCK8实验、qPCR和Western blot鉴定成年小鼠及乳鼠触液神经元的自我更新能力。结果与结论:①实验成功在成年小鼠体内分离出高纯度触液神经元,在体外表达Nestin及SOX2,能形成神经球并连续传代。②成年小鼠触液神经元体外自我更新能力较乳鼠相比明显减弱,细胞培养到第4天时乳鼠触液神经元已经形成直径约为150μm的神经球,而成年小鼠触液神经元所形成的神经球直径仅为40μm(P<0.0001)。③CCK8增殖实验结果表明,成年小鼠触液神经元的增殖活性在培养后各时间点显著弱于乳鼠(P<0.0001)。④qPCR和Western blot检测发现成年小鼠触液神经元Nestin及SOX2的mRNA(P<0.0001)和蛋白表达量(P<0.01)较乳鼠显著下降。⑤上述结果证实,成年小鼠触液神经元的体外自我更新能力显著弱于乳鼠。

拮抗触液核细胞外信号调节蛋白激酶5对吗啡依赖大鼠戒断行为的影响

目的探讨触液核磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶5（ERK5）在吗啡依赖大鼠戒断行为中的作用。方法成年♂sD大鼠48只，体质量230-270g，采用随机数字法，将大鼠随机分为两组（n=24）：吗啡-纳洛酮-DMSO组（A组）和吗啡-纳洛酮-BIX02188组（B组）。采用剂量递增法皮下注射吗啡以建立大鼠吗啡依赖模型，d 6上午经腹腔注射纳洛酮，催促戒断症状出现，即建立吗啡戒断模型。采用行为药理学方法结合免疫荧光技术，侧脑室内注射ERK5特异性抑制剂BIX02188，观察其对吗啡依赖大鼠戒断行为、戒断所致痛觉过敏及触液核p-ERK5表达的影响。结果与吗啡-纳洛酮-DMSO组相比，吗啡一纳洛酮．BIX02188组大鼠跳跃、咬牙、湿狗样抖动、腹泻及体重减轻等戒断症状明显缓解（P〈0．05），而扭体、流涎无改善（P〉0．05）；戒断所致痛觉过敏明显减轻（P〈0．05）。与吗啡一纳洛酮-DMSO组相比，吗啡一纳洛酮-BIX02188组大鼠触液核p-ERK5阳性神经元数量明显减少（P〈0．05）。结论拮抗触液核ERK5可减轻吗啡依赖大鼠戒断症状，提示触液核ERK5参与吗啡依赖大鼠戒断症状的表达。

拮抗触液核P物质对吗啡戒断大鼠行为学的影响

目的观察P物质(substance P,SP)在吗啡戒断大鼠触液核内的表达及拮抗触液核内SP对吗啡戒断行为学的影响,探讨触液核内SP在吗啡戒断中的作用。方法 SPF级SD♂大鼠2组,吗啡戒断-人工脑脊液组(A组)和吗啡戒断-SP抑制剂组(B组);两组均采用剂量递增法腹腔注射盐酸吗啡,建立大鼠吗啡依赖模型,在d4上午侧脑室注射霍乱毒素亚单位B-辣根过氧化物酶复合物(CB-HRP)逆行追踪触液神经元;B组d5上午在立体定位仪下侧脑室注射SP拮抗剂(D-Pro2、D-Phe7、D-Trp9)-SP,A组注射人工脑脊液作为对照组;d6上午腹腔注射纳络酮(5mg·kg-1)建立吗啡戒断模型;并进行戒断行为学评分、记录戒断总评分(total withdrawal scores,TWS),免疫荧光结合激光共聚焦显微镜观察SP的表达。结果 A组大鼠触液核内SP表达增加,B组显示,拮抗触液核内SP可减弱吗啡戒断样症状;两组TWS相比较,A组高于B组(P<0.01)。结论抑制触液核内SP能够减轻吗啡戒断症状,本研究首次证实触液核SP表达参与了吗啡躯体依赖的发展与纳洛酮药物催促戒断,这将有助于利用药理学手段干预阿片依赖寻找新方法。

大鼠远位触液神经元一氧化氮合酶的表达及其与吗啡戒断的关系

目的观测神经元型一氧化氮合酶（nNOS）在大鼠远位接触脑脊液神经元（CSF—CNs）中的表达，探索nNOS远位触液神经元在吗啡依赖和戒断形成过程中的作用。方法♂成年SD大鼠（260±20）g，侧脑室引入30％霍乱毒素亚单位B与辣根过氧化物酶复合物（CB—HRP）追踪定位鉴别远位触液神经元。取材相关部位，连续冠状冰冻切片，TMB—ST法行CB—HRP呈色反应，进一步nNOS免疫组织化学双重标记。行为学观测并计数各组动物相同层面脑片上CB—HRP和CB—HRP／nNOS两种标记细胞的表达情况。结果戒断组大鼠，戒断症状及总评分较对照组和吗啡依赖组大鼠差异有显著性（P〈0．01）；给NOS抑制剂组戒断症状评分较戒断组明显降低（P〈0．05）。各组动物脑片恒定部位出现CB—HRP阳性标记神经元，差异无显著性。正常组、对照组及依赖组计数到约3％～8．0％的CB—HRP／nNOS双标记神经元，差异无显著性；戒断组大鼠计数到56．9％的CB—HRP／nNOS双标记神经元，较对照组及依赖组明显增加（P〈0．01）；NOS抑制剂组大鼠计数到32．0％CB—HRP／nNOS双标记神经元，较戒断组CB—HRP／nNOS双标记神经元明显减少（P〈0．05）。结论大鼠脑实质内存在nNOS远位触液神经元，nNOS远位触液神经元可能参与了吗啡戒断的形成。

坐骨神经松扎致神经病理性疼痛诱导触液神经元ERK1／2蛋白的表达

目的:探讨远位触液神经元在坐骨神经松扎致神经病理性疼痛信息调控中的作用。方法:采用CB-HRP/pERK1/2双重标记技术,观察坐骨神经松扎致神经病理性疼痛大鼠远位触液神经元中ERK1/2样免疫反应蛋白(pERK1/2)表达的变化。结果:坐骨神经松扎致神经病理性疼痛刺激后,不仅热痛觉阈值显著下降,而且远位触液神经元内的ERK1/2蛋白活化表达的数量显著增加,与空白对照组比较有显著性差异。结论:远位触液神经元可能参与了机体对坐骨神经松扎致神经病理性疼痛的信息传递或调控。

烫伤大鼠室旁核和触液神经元中胆囊收缩素的变化

目的明确胆囊收缩素在烫伤应激中的确切作用。方法在大鼠清醒状态下给予标准的２５％Ⅲ度皮肤烫伤，伤后２４ｈ杀动物，用免疫细胞化学ＡＢＣ法显示ＰＶＮ和ＣＳＦ－ＣＮｓ的ＣＣＫ阳性神经元，结果用显微图像分析技术处理。结果（１）烫伤大鼠ＰＶＮ代表平面ＣＣＫ神经元的总面积增大，免疫染色无明显变化。（２）正中隆起（ｍｅｄｉｎｅｍｉｎｅｎｃｅ，ＭＥ）的ＣＣＫ免疫染色阳性纤维的面积密度无显著性差异而免疫染色减弱。（３）烫伤大鼠第三脑室室管膜内ＣＣＫ免疫染色阳性的ＣＳＦ－ＣＮｓ数量、面积和免疫染色强度均高于对照组。结论烫伤应激使ＣＣＫ在胞体的合成和末梢的释放均增加。烫伤后大量ＣＳＦ－ＣＮｓ的出现为ＣＣＫ释放入脑脊液提供了一条新的途径。

鞘内注射左旋布比卡因下调甲醛炎性痛大鼠远位触液神经元P物质的表达

目的观察鞘内注射左旋布比卡因对甲醛炎性痛大鼠P物质（substance P，SP）在脊髓背角及远位触液神经元（the distal cerebrospinal fluid contacting neuron，dCSF-CN）表达的影响。方法采用CB-HRP大鼠侧脑室注射示踪标记dCSFCN；48h后先鞘内注射0．5％左旋布比卡因10μl（并以鞘内注射10μl人工脑脊液作对照），大鼠左后掌足跖部皮下注射2．5％福尔马林建立炎性痛模型，记录大鼠舔足时间，1h后测定机械缩足阚值（mechanical withdrawal threshold，MWT）评估机械痛敏；免疫组织化学光镜镜检及免疫电镜镜检P物质在脊髓背角（L4-5，）及dCSF-CN的表达。结果鞘内注射左旋布比卡因减少大鼠福尔马林试验的舔足时间（P〈0．01），MWT值无变化（与基础值对比，P〉0．05），sP在脊髓背角及dcSF．CN的表达弱于对照组（P〈0．01）。结论鞘内注射左旋布比卡因减低脊髓伤害性疼痛反应及下调SP在dCSF-CN的表达。

中缝背核内远位触液神经元超微结构及其与周围组织的联系

目的观察中缝背核内远位触液神经元的超微结构及其与周围组织的联系,为探讨该类神经元的功能奠定形态学基础。方法使用霍乱毒素亚单位B与HRP结合物(CB-HRP)-电镜法。结果1.中缝背核内远位触液神经元具有一般神经元的形态及各种细胞器结构;2.CB-HRP沉淀物主要分布在触液神经元高尔基复合体的trans面以及溶酶体内;3.触液神经元与其他中枢神经元之间存在着方向相反的两种突触联系。结论1.中缝背核内远位触液神经元在形态及细胞器构成上与其他中枢神经元未见明显不同;2.其高尔基复合体和溶酶体在摄取外来物质的代谢和转运过程中可能存在特殊功能;3.该类神经元可以在中缝背核与脑脊液之间起到双向传递的作用。

乙状结肠痛诱导大鼠远位触液神经元Fos蛋白的表达

目的:探讨远位触液神经元在乙状结肠痛刺激信息调控中的作用。方法:采用CB-HRP/Fos双重标记技术,观察乙状结肠痛大鼠远位触液神经元中Fos样免疫反应蛋白(Fos)表达的变化。结果:乙状结肠痛刺激后,不仅疼痛行为学评分显著增加,而且远位触液神经元内Fos表达的数量显著增加,与空白对照组相比有显著性差异。结论:远位触液神经元可能参与了机体对乙状结肠痛刺激信息传递或调控。

大鼠第三脑室室周区一氧化氮合酶阳性触液神经元的分布

目的 :观察大鼠第三脑室室周区 ( 3 V- Pe)内一氧化氮合酶 ( NOS)阳性触液神经元 ( CSFCN)的形态及分布特征 ,为了解一氧化氮 ( NO)在脑 -脑脊液神经体液回路中的调节作用提供形态学资料。方法 :用黄递酶组织化学染色方法研究 NOS神经元在大鼠 3 V- Pe的分布及其形态特点。结果 :3 V- Pe均有 NOS- CSFCN分布 ,由前腹侧渐向后背侧过渡。细胞可分 4种类型 ,位于室管膜内或其下层 ,或距之有一定的距离 ,但有突起伸向第三脑室。室旁核内有众多 NOS阳性纤维向第三脑室伸展 ,与 3 V- PeNOS- CSFCN相互交错、邻接。结论 :3 V- Pe NOS- CSFCN与脑脊液非常接近 ,提示它们自脑脊液获得信息 ,并能向脑脊液分泌NO,很可能具有神经

Drebrin在坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠远位触液神经元的表达

为观察坐骨神经慢性压迫性损伤(chronic constriction injury,CCI)后大鼠远位触液神经元(distal cerebrospinal fluid con-tacting neurons,dCSF-CNs)中drebrin的表达,探讨免疫荧光技术用于dCSF-CNs研究的可能性,将雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为空白对照组、假手术组和CCI组,采用侧脑室注射霍乱毒素亚单位B(choleratoxin subunit B,CB)与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)结合物(CB-HRP)示踪标记大鼠dCSF-CNs,观测三组大鼠行为学评分,并应用免疫荧光双标记和激光共聚焦显微镜技术比较各组dCSF-CNs中drebrin的表达。结果显示,三组中仅CCI组大鼠痛阈下降,三组大鼠dCSF-CNs均显示清晰,空白对照组和假手术组dCSF-CNs胞浆内无drebrin表达,CCI组dCSF-CNs胞浆内drebrin表达较多。结果表明,应用免疫荧光双标记观察dCSF-CNs,形态清晰,技术可靠。dCSF-CNs可能参与了神经病理性疼痛的信息传递。

毁损大鼠中缝背核内触液神经元对吗啡依赖和戒断的影响

目的:探索脑内远位触液神经元在吗啡依赖和戒断形成过程中的作用。方法:化学性神经元毁损、侧脑室引入霍乱毒素亚单位B与辣根过氧化物酶复合物(CB-HRP)神经示踪、TMB-ST呈色反应,Western blot、nNOS免疫组织化学。结果:毁损大鼠中缝背核内远位触液神经元后,纳洛酮催促的戒断症状明显减弱,戒断症状评分较戒断未毁损组降低约38%(P<0.05);给予溶媒和毁损触液神经元旁侧的大鼠戒断症状与戒断组比较未见明显变化(P>0.05)。毁损组脑片触液神经元密集区局部细胞损坏明显,仅在其毁损区边缘观测到少量CB-HRP阳性细胞。未毁损组CB-HRP标记细胞位置及数量恒定,形态清晰。毁损触液神经元后,脊髓背角nNOS阳性神经元计数及nNOS蛋白表达较戒断未毁损组减少明显(P<0.05),而较正常组和依赖组增加仍显著(P<0.01)。结论:毁损大鼠中缝背核内部分远位触液神经元可减弱吗啡戒断症状和脊髓背角神经元型一氧化氮合酶的表达,提示中缝背核内部分远位触液神经元可能参与了吗啡依赖和戒断的形成,NO介导脑内触液神经元与脊髓水平对吗啡依赖和戒断的调节。

大鼠脑实质内远位触液神经元中5-HT_(1A)受体的分布及其在神经病理性痛中的表达

本文旨在探讨大鼠脑实质内远位触液神经元中5-HT1A受体的分布及其在神经病理性痛中的作用。慢性结扎损伤坐骨神经建立大鼠神经病理性痛模型,分别以缩足潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)和缩足阈值(paw withdrawal threshold,PWT)对大鼠热痛敏和机械触诱发痛反应进行评分,以可靠CB-HRP(cholera toxin subunit B with horseradish peroxidase)法追踪标记脑实质内远位触液神经元,用CB-HRP/5-HT1A受体免疫组织化学双重标记技术定位、鉴别5-HT1A受体在远位触液神经元中的表达,并计数分析5-HT1A受体分布和表达变化与痛行为表现之间的关系。结果表明,在神经病理性痛第1、3、7、14天,大鼠的PWL分别为19.37±2.74、12.04±1.77、8.74±1.15、12.31±1.94,PWT分别为18.58±3.62、13.05±1.81、6.66±1.43、11.55±2.01。CB-HRP标记细胞出现的位置和数量恒定。每只动物CB-HRP/5-HT1A受体双重标记的细胞数量分别为276.14±36.00、161.72±28.41、108.64±6.81、139.76±44.64,分别占该动物CB-HRP标记细胞总数的95%、60%、40%和55%。与对照组相比,神经病理性痛大鼠PWL、PWT及CB-HRP/5-HT1A受体双标细胞数均有显著性差异(P<0.01)。结果提示,大鼠脑实质的特定部位恒定存在远位触液神经元,该类神经元大多含有5-HT1A受体,该受体的表达与神经病理性痛行为表现之间呈负相关关系。

中缝背核远位触液神经元与脑实质之间超微结构的联系

目的：研究大鼠中缝背核内远位触液神经元与脑实质结构之间的超微结构联系，以探明这种神经元传递信息的方向。方法：用霍乱毒素亚单位Ｂ与辣根过氧化物酶复合物（ＣＢ－ＨＲＰ）顺、逆行追踪与电镜技术相结合。结果：中缝背核的触液神经元（以“＋”表示）与脑实质的非触液神经元（以“－”表示）之间主要有两种突触形式：轴（－）－树（＋）突触和树（－）－树（＋）突触，标记的树突多成簇状分布，有的形成树突中心球样的结构，在第三脑室侧壁尚见有被标记的轴突终末伸入脑脊液中。这些突触既有 ＧｒａｙⅠ型（兴奋型），也有 Ｇｒａｙ Ⅱ型（抑制型），但它们的共同特点是突触前成分均为非触液神经元的结构构成，突触后成分均为触液神经元的结构构成。结论：中缝背核的远位触液神经元既可以接受兴奋性信息，也可以接受抑制性信息，并将这些信息自脑实质向脑脊液方向传递。

缺氧诱导大鼠中缝背核远位触液神经元表达Fos蛋白(英文)

本文旨在研究缺氧刺激条件下中缝背核内远位触液神经元Fos蛋白的表达情况。应用低压氧舱仿海拔8000米高空缺氧模型,采用侧脑室注射CB(霍乱毒素B亚单位)标记中缝背核内的远位触液神经元,并用Fos免疫组化和CB/Fos免疫组化双重染色方法显示Fos在中缝背核远位触液神经元内的表达情况。结果表明中缝背核内存在大量的CB标记神经元(31.16±3.36/每张切片)。缺氧实验组中缝背核内Fos阳性神经元数显著增加(40.28±2.17/每张切片,P<0.05),并可见CB/Fos双标神经元(2.00±0.39/每张切片)。对照组中缝背核内Fos阳性神经元数较少(5.55±0.81/每张切片),未见CB/Fos双标神经元。本文结果提示在缺氧刺激条件下,中缝背核内部分远位触液神经元在脑脑脊液之间的信息传递及功能调节中可能发挥一定作用。

黑质多巴胺触液神经元

将30％ HRP 8—10μl或3％碘化丙啶(PI)3μl分别注入两组动物单侧侧脑室内,48小时后将鼠处死,检查中脑切片。发现双侧黑质均司见HRP标记细胞群,但以同侧为主。标记范围以中脑中上部为多。标记细胞主要分布在黑质致密带内侧部,网状带中仅少数散在。注射PI例所见类同,但标记细胞远较HRP标记细胞为多。TH免疫组化法发现黑质DA神经元投射纤维分散布于尾壳核,并见TH阳性投射纤维在室管膜上皮细胞的深面形成密集的膨大,个别地区还见阳性终末突入侧脑室。另外,在接受胚中脑黑质移植存活良好的受体鼠纹状体中,发现少数移植存活的TH阳性黑质DA神经元胞体或其突起伸入侧脑室室管膜上皮细胞间甚或突入室腔。实验表明部分黑质多巴胺神经元系触液神经元,提示可能直接释放DA入脑脊液。当胚黑质细胞被移植入受体脑纹状体后,部分黑质DA神经元重演其发育的规律,将其突起或胞体伸入室管膜上皮细胞间或突入侧脑室,以代偿其原有的功能。

大鼠第三脑室一氧化氮合酶阳性触液神经元的分布及与催产素的共存

应用 NADPH-d组织化学方法观察了大鼠第三脑室一氧化氮合酶阳性触液神经元的分布及其形态 ,并结合免疫组织化学技术研究了一氧化氮合酶与催产素在第三脑室触液神经元内的共存。结果显示 :在视前区至室间核后大细胞亚核平面的第三脑室室壁均有一氧化氮合酶阳性触液神经元分布 ,呈自前向后 ,由腹侧部渐向背侧部过渡迁移的特征。一氧化氮合酶阳性触液神经元绝大部分为大细胞型标记神经元 ,胞体呈卵圆形、梭形、多角形与倒置梨形。它们位于脑室管膜内、室管膜下 ,或距室管膜有一定距离处 ,但有突起伸至第三脑室。第三脑室催产素免疫阳性触液神经元的形态及分布与一氧化氮合酶阳性触液神经元基本相似 ,两者高度共存。催产素 /一氧化氮合酶双标神经元 ,约占阳性细胞总数的 90 .9%。上述三种阳性触液神经元与邻近核团关系密切 ,尤其与室旁核之间有很多的阳性纤维互相交错。本研究结果表明 ,第三脑室有大量的一氧化氮合酶与催产素免疫阳性神经元分布 ,并且高度共存 ,从而建立了催产素的下丘脑 -脑脊液 -垂体神经体液调节环路的结构基础 。

慢性吗啡依赖和戒断对大鼠远位触液神经元环腺苷酸反应元件结合蛋白表达的影响

目的研究慢性吗啡依赖和戒断大鼠远位触液神经元环腺苷酸反应元件结合蛋白(pCREB)表达的变化。方法雄性SD大鼠24只,随机分为3组(n=8):空白对照组、慢性吗啡依赖组、慢性吗啡戒断组。采用侧脑室注射CB-HRP和CB-HRP/pCREB免疫组织化学双重标记技术,观察大鼠远位触液神经元pCREB表达的变化。结果慢性吗啡依赖、戒断后,远位触液神经元出现CREB蛋白激活,两组CB-HRP/pCREB双标的神经元数量分别为223.0±61.5和213.0±50.6;与空白对照组相比较,磷酸化的CREB出现表达上调(P<0.01)。吗啡依赖组和戒断组的CB-HRP双标神经元的数量相比,差异无显著性(P>0.05)。结论远位触液神经元通过上调磷酸化CREB的表达参与吗啡依赖和戒断的形成。

大鼠中缝背核内一氧化氮合酶阳性原位触液神经元的观察

通过研究大鼠中缝背核内远位触液神经元与一氧化氮合酶 (NOS)阳性神经元的关系 ,以探讨一氧化氮 (NO)是否与触液神经元在脑—脑脊液之间的信息传递有关。选用霍乱毒素亚单位 B标记的辣根过氧化物酶 (CB- HRP)逆行追踪与还原型尼可酰胺腺嘌呤二核苷磷酸 (NA DPH)黄递酶反应。 CB- HRP标记的神经元密集分布于中缝背核 ,可见 CB- HRP/NADPH- d双重标记的神经元。中缝背核内一部分远位触液神经元存在 NOS。

大鼠第三脑室及中脑水管多巴胺能触液神经元的分布

目的 观察大鼠第三脑室、中脑水管及中缝背核内多巴胺能触液神经元的分布情况。方法 应用 CB逆行追踪、TH免疫组织化学和CB/TH免疫荧光双重标记技术, 观察多巴胺能触液神经元在间脑及中脑内的分布情况。结果 TH免疫阳性触液神经元分布在第三脑室尾侧部和中脑水管全程的腹侧室管膜上及室管膜内, 其胞体呈倒置梨形、圆形或椭圆形、多角形和梭形; 在中缝背核内可见少量 CB/TH免疫荧光双重标记的远位触液神经元; 另在正中隆起部位 TH免疫阳性神经末梢含量丰富。结论 大鼠第三脑室、中脑水管及中缝背核内存在多巴胺能触液神经元, 其在脑-脑脊液之间的信息传递中有着重要的作用。