基于药效团和分子对接探究诃子制草乌通过瞬时受体电位香草酸1介导的减毒机制

目的:本研究利用药效团、分子对接及实时反转录PCR(RT-PCR)方法探究诃子制草乌通过瞬时受体电位香草酸1(TRPV1)介导的减毒机制。方法:采用Discovery Studio 4.0软件构建基于TRPV1激动剂分子共同特征的TRPV1激活药效团,虚拟筛选出草乌中的潜在活性成分;对草乌成分及诃子制草乌中引入的诃子成分进行Autodock vina分子对接研究;根据结果选出代表性成分,采用实时反转录PCR验证是否可促进心肌细胞中TRPV1 mRNA表达。结果:药效团共筛选出草乌中包括毒性较大的双酯型生物碱乌头碱、新乌头碱及次乌头碱在内的13个成分,分子对接结果表明这13个成分及诃子制草乌引入的诃子成分均有潜力与TRPV1结合。RT-PCR实验中没食子酸和新乌头碱在浓度≥25μmol/L时,均可明显促进大鼠H9c2心肌细胞中TRPV1 mRNA表达的增加,随着给药浓度的增大表达量增加,新乌头碱促进TRPV1 mRNA表达的作用更强。药效团、分子对接结果表明诃子和草乌中均含有多种具备TRPV1激活潜力的成分。结论:实验证明新乌头碱、没食子酸均可在一定程度上激活TRPV1通道,可作为TRPV1的激动剂。根据结果推测,诃子可能会通过拮抗草乌中的活性成分与TRPV1的结合,从而降低草乌通过TRPV1介导的毒性;也可能是诃子制草乌在引入没食子酸等诃子成分后,可在安全剂量范围内使TRPV1通道快速脱敏从而实现减毒。

诃子制草乌对蒙药嘎日迪-5镇痛抗炎作用的影响

目的:不同条件诃子制草乌对蒙药嘎日迪-5镇痛抗炎作用的影响。方法:比较3个不同条件(诃子汤中浸泡12h,煎煮2h[A]、诃子汤中浸泡24h,煎煮2h[B]、诃子汤中浸泡4天[C])诃子制草乌和生草乌配制嘎日迪-5混悬液的热板法镇痛作用、二甲苯致小鼠耳廓肿胀法抗炎作用。结果:对小鼠热板法致疼痛刺激反应比较结果为:在A条件炮制草乌配成的蒙药嘎日迪-5混悬液两个剂量组给药后30min、60 min时都有明显的镇痛作用(分别P<0.05和P<0.01)、B条件炮制草乌配成的蒙药嘎日迪-5混悬液高剂量组给药60 min以后不但没有镇痛作用反而有兴奋作用(P<0.05)、C条件炮制草乌配成的低、高剂量组给药60 min以后不但没有镇痛作用反而有兴奋作用(分别P<0.01、P<0.001)。对二甲苯致小鼠耳廓肿胀炎症的影响比较结果为:在A条件炮制草乌配成的蒙药嘎日迪-5混悬液两个剂量组都有明显的预防和治疗作用(P<0.05);B条件炮制草乌配成的蒙药嘎日迪-5混悬液高剂量组有明显的预防和治疗作用(P<0.01);C条件炮制草乌配成的蒙药嘎日迪-5混悬液没有明显的预防和治疗作用;生药组对小鼠热板法致疼痛刺激反应和对二甲苯致小鼠耳廓肿胀炎症都没有镇痛和抗炎作用。结论:初步研究证明在A条件炮制草乌配成的蒙药嘎日迪-5混悬液镇痛、抗炎作用最佳,此炮制方法和条件为诃子制草乌的进一步规范化研究和临床应用提供试验依据。

生草乌和诃子制草乌细胞毒性及抗炎作用的比较研究

目的:比较生草乌和诃子制草乌的细胞毒性及抗炎作用。方法:以大鼠心肌细胞H9c2为对象,采用CCK-8法检测0.5、1、2、4、6、8、10 mg/mL生草乌和诃子制草乌作用4、8、12、24 h对细胞抑制率的影响,采用Hoechst 33258染色法观察2、4、6 mg/mL生草乌和诃子制草乌作用24 h对细胞形态学特征的影响。以小鼠巨噬细胞RAW264.7为对象,采用CCK-8法检测0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2 mg/mL生草乌和诃子制草乌作用24 h对细胞存活率的影响,采用酶联免疫吸附试验法检测0.05、0.1、0.25、0.5mg/mL生草乌和诃子制草乌对LPS致RAW264.7炎症细胞中一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)释放的影响。结果:当质量浓度为0.5、1 mg/mL时,生草乌和诃子制草乌对H9c2细胞几乎均无抑制作用;当质量浓度为2 mg/mL时,诃子制草乌在各时间点对H9c2细胞的抑制率均显著高于生草乌(P<0.05或P<0.01),且作用24 h的细胞荧光强度虽强于生草乌,但其细胞核完整;当质量浓度为4~10 mg/mL时,诃子制草乌在各时间点(除8、10 mg/mL作用24 h外)对H9c2细胞的抑制率均显著低于生草乌(P<0.05或P<0.01),且4、6 mg/mL生草乌组细胞的荧光强度强于诃子制草乌组,同时生草乌组的细胞核破碎现象更为严重。0.05~0.5 mg/mL的生草乌和诃子制草乌对RAW264.7细胞均无毒性,0.25、0.5 mg/mL的生草乌和0.1、0.25、0.5 mg/mL的诃子制草乌对RAW264.7炎症细胞中NO的释放以及0.05、0.1、0.25、0.5 mg/mL的生草乌和诃子制草乌对RAW264.7炎症细胞中TNF-α、IL-6的释放均有显著的抑制作用(P<0.05或P<0.01),其中相同质量浓度下诃子制草乌对NO释放的抑制作用优于生草乌,对TNF-α、IL-6释放的抑制作用弱于生草乌。结论:草乌经诃子汤炮制后毒性有所降低,尤其是以中或高浓度、短期内使用的毒性低于生草乌。同时,诃子制草乌的抗炎作用与同浓度生草乌相当。

基于均匀设计的诃子制草乌特征性成分对H9c2心肌细胞毒性的影响

目的:筛选诃子制草乌特征性成分中的主要毒性作用成分和减毒作用成分。方法:采用均匀设计法安排实验,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法考察诃子制草乌中4种特征性成分的不同配比对H9c2心肌细胞存活率的影响;应用Data Processing System(DPS)数据处理软件,对不同配比的细胞存活率进行逐步回归并绘制等高线图,分析4种特征性成分对H9c2心肌细胞毒性的影响及交互作用关系;以细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、细胞核平均荧光强度、线粒体膜电位为指标进一步对分析结果进行实验验证。结果:4种指标性成分中,存在于草乌中的新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱均可明显降低H9c2心肌细胞存活率,以新乌头碱对毒性的贡献更大;诃子中的没食子酸、鞣花酸均可提高模型组(新乌头碱+苯甲酰新乌头原碱)细胞存活率,且没食子酸的作用强于鞣花酸。从交互作用的程度来看,具有显著降低H9c2心肌细胞存活率的交互项为新乌头碱和苯甲酰新乌头原碱;而交互项新乌头碱和鞣花酸、苯甲酰新乌头原碱和没食子酸可明显提高H9c2心肌细胞存活率。实验证实,新乌头碱和苯甲酰新乌头原碱共同作用,与对照组相比,细胞存活率明显降低(P<0.01),LDH漏出率和细胞核平均荧光强度增加(P<0.01),线粒体膜电位降低(P<0.01);在新乌头碱和苯甲酰新乌头原碱混合物中单独加入没食子酸或鞣花酸均可提高细胞存活率(P<0.01),升高线粒体膜电位(P<0.05或P<0.01),降低LDH的漏出和细胞核平均荧光强度(P<0.01);同时加入没食子酸和鞣花酸,其毒性作用进一步减弱。结论:诃子制草乌中的新乌头碱和苯甲酰新乌头原碱均具有一定的心肌毒性,以新乌头碱对毒性的贡献更大,两者具有协同作用;没食子酸和鞣花酸均可降低由两种乌头碱类成分产生的毒性作用,以没食子酸的减毒作用贡献更大,两者具有协同作用。

诃子制草乌对蒙药嘎日迪-5镇痛抗炎作用的影响

目的研究诃子制草乌对蒙药嘎日迪-5(以下简称嘎日迪-5)镇痛抗炎作用的影响。方法比较不同诃子制草乌方法以及不同剂量的嘎日迪-5对小鼠热板镇痛效果和耳廓肿胀消炎效果。结果 12h低剂量组30min痛阈值为(48.31±11.81)s、60min为(45.10±14.01)s,12h高剂量30min痛阈值为(50.31±14.09)s、60min为(47.17±7.34)s均显著高于对照组的(37.41±4.37)s、(31.78±15.21)s,差异均具统计学意义(均P<0.05)。24h低剂量组60min后痛阈值为(24.65±5.43)s、24h高剂量组为(21.34±5.57)s、4d低剂量组为(26.14±5.81)s、4d高剂量组为(23.40±6.51)s,均显著低于对照组的(31.78±15.21)s,12h低剂量小鼠耳朵肿胀程度为(9.324±4.167)mg、12h高剂量的为(9.528±2.389)mg、24h高剂量组为(8.876±3.320)mg,均显著低于对照组的(13.258±3.751)mg。差异均具统计学意义(均P<0.05)。结论研究表明使用浸泡12h,蒸煮2h的制草乌配置而成的嘎日迪-5镇痛抗炎相对更好。

Elisa法测定口服诃子制草乌的大鼠心肌cTn

目的:测定大鼠口服诃子制草乌的心肌钙蛋白,为临床提供安全用药实验数据。方法:Elisa法测定大鼠心肌钙蛋白T,并对实验结果进行T检验。结果:Elisa法能够早期预测大鼠口服诃子制草乌后的心脏毒性,为临床安全用药提供了可靠的早期预测。

辅料因素对炮制蒙药诃子制草乌质量的影响

目的探讨辅料因素对蒙药诃子制草乌质量的影响,阐明辅料发挥炮制减毒作用的原理,优选出最佳炮制工艺。方法煎煮制备不同比例的诃子汤作为炮制辅料,分别测定其p H值、总鞣质含量。并用不同比例的诃子汤分别炮制草乌,采用反相高效液相色谱法检测各炮制品中代表毒效成分的6种生物碱含量。结果随诃子用量增加,诃子汤中总鞣质含量不断升高;诃子汤p H值先减小,后基本维持稳定;诃子制草乌中6种生物碱总量先逐渐升高后变化不规律。其中草乌、诃子比例为2∶1时,诃子制草乌中生物碱含量达到最低,该比例与1986年《内蒙古蒙药材标准》中对诃子、草乌炮制用量的比例一致。结论诃子用量及炮制辅料是否新鲜均会影响诃子制草乌中生物碱含量大小,《内蒙古蒙药材标准》对诃子、草乌炮制用量比2∶1具有一定的科学性,建议继续沿用。

诃子制草乌模拟炮制品在人工胃液与肠液中的水解行为研究

目的：研究诃子制草乌模拟炮制品在人工胃液与肠液中的水解行为,明确二者相互作用机制,为诃子制草乌的炮制减毒提供依据。方法：采用高相液相色谱（HPLC）法测定诃子制草乌在人工胃肠液中孵育不同时间（胃液中孵育2 h,肠液中孵育5、6、7、8 h）后其降解产物乌头碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酸的含量。结果：诃子制草乌中乌头碱含量在人工胃液中减少,在人工肠液中明显回升,在人工肠液孵育6~8 h时含量稳定;诃子制草乌中苯甲酰乌头原碱在人工胃液中未测得,在人工肠液中测得;诃子制草乌中苯甲酸在人工胃肠液中含量变化呈先递增再递减的趋势,且在人工肠液中孵育6 h时达最大值,7~8 h时维持稳定。结论：诃子制草乌炮制过程中鞣质与乌头碱可能结合生成难溶性物质,胃肠液p H对游离乌头碱的释放和水解有一定影响,人工胃液酸性环境对其水解有抑制作用,而人工肠液碱性环境对其水解有促进作用。

基于TRPV1通道分析诃子制草乌减轻H9c2心肌细胞毒性的作用机制

目的:探究瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)通道在诃子制草乌减轻心肌细胞毒性中的作用机制。方法:以体外培养的H9c2心肌细胞为模型,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测心肌细胞中TRPV1 mRNA的表达水平;酶联免疫吸附测定试验(ELISA)检测细胞中乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,细胞核,活性氧(ROS),线粒体膜电位及钙离子(Ca^(2+))含量的变化。结果:与空白组比较,当质量浓度≥0.5 g·L^(-1)时,生草乌、诃子制草乌均可显著降低细胞活力(P<0.01),细胞中LDH漏出率,ROS及Ca^(2+)释放量增加,线粒体膜电位降低,细胞核固缩甚至是破碎。当质量浓度≥0.5 g·L^(-1)时,与同质量浓度生草乌组相比,诃子制草乌组细胞活力显著上升(P<0.01),细胞中LDH漏出率,ROS及Ca^(2+)释放量减少,线粒体膜电位升高,细胞核形态有所改善。与作用于未经处理的H9c2心肌细胞比较,同质量浓度的生草乌作用于TRPV1抑制剂BCTC预处理后的H9c2心肌细胞后,其细胞活力明显上升,细胞中LDH漏出率,ROS及Ca^(2+)释放量减少,线粒体膜电位升高,细胞核固缩程度得到改善;而同质量浓度的诃子制草乌作用于BCTC预处理后的H9c2心肌细胞,其细胞活力下降,细胞中LDH漏出率,ROS及Ca^(2+)释放量增加,线粒体膜电位降低。Real-time PCR结果表明,草乌和辅料诃子汤均能使心肌细胞中TRPV1 mRNA表达量增多,且呈现浓度依赖性。结论:生草乌可通过激活TRPV1通道诱导心肌细胞凋亡,引发心脏毒性;而诃子制草乌可通过TRPV1通道介导起到减毒作用,其减毒作用的发挥可能与诃子中的酸性成分和草乌中的生物碱协同作用于TRPV1通道有关。

草乌及其炮制品的急性毒性实验研究

目的比较生草乌、药典法制草乌、诃子制草乌的粉末和水煎液及诃子草乌配伍煎煮液7种样品急性毒性大小,探讨草乌炮制减毒原理。方法采用灌胃给药的方法,分别测定7种草乌样品对小鼠半数致死量(LD50)或最大给药量。结果生草乌粉末、诃子制草乌粉末、诃子草乌配伍煎液、诃子制草乌煎液、生草乌煎液的LD50分别为0.7009、1.1690、2.5600、4.0000、15.3200 g·kg-1;药典法制草乌粉末、药典法制草乌水煎液最大给药量分为20 g·kg-1和64 g·kg-1。结论生草乌毒性较大,生品经炮制或水煎煮后毒性均有不同程度降低。药典法制草乌无论粉末还是水煎液均无明显毒性。

蒙药草乌及其炮制品的六种生物碱类成分血浆中含量测定

目的:建立血浆中,草乌及其诃子汤炮制品的6种生物碱类成分LC-MS含量测定的方法。方法:血浆样品用加25%氨水、乙醚萃取后,采用ZORbax-Extend-C18 4.6×250mm 5-Micron 80A柱子检测,流动相水相为10mmol醋酸铵水溶液(氨水调ph=9.0)有机相为乙腈,选择离子检测m/z 604(苯甲酰乌头原碱)、m/z 590(苯甲酰新乌头原碱)、m/z 574(苯甲酰次乌头原碱)m/z 632(新乌头碱)、m/z 646(乌头碱)、m/z 616(次乌头碱)。结果:本方法 6种成分线性关系均良好,精密度、稳定性、基质效应RSD都低于10%,加样回收率为59.11%~96.57%。结论:此样品处理快速简便、检测方法精密度高,适用于血浆中新乌头碱、次乌头碱、乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱检测,以其为草乌及诃子汤炮制草乌的进一步药代毒代动力学研究提供参考。

应用UPLC-Orbitrap-MS分析草乌及其不同炮制品化学成分差异

草乌是有毒药之一,需经过炮制后方能使用。中药中草乌常用的炮制方法为水煮至内无白心,口尝微有麻舌感,蒙古族药中常用诃子制草乌,2种方法均能减毒。该实验利用UPLC-Orbitrap-MS对生草乌、药典法制草乌、诃子制草乌进行分析,比较炮制前后化学成分变化,为阐明诃子制草乌炮制减毒原理提供依据。通过比对生草乌与各炮制品的正负离子模式离子流出峰分析草乌炮制前后成分变化情况,并以化合物炮制前后离子峰面积比为炮制前后变化指数,将草乌主要活性成分经2种炮制方法炮制后的含量变化趋势进行对比,发现生草乌经药典法炮制后,新增14-O-anisoylneoline,dehydro-mesaconitine等14种成分,同时N-demethyl-mesaconitine,aconitine消失,且双酯型生物碱含量明显减少,单酯型和醇胺型生物碱含量明显增加,说明药典法制草乌是通过降低主要毒性成分双酯型生物碱的含量来减毒的;草乌经诃子汤炮制后,原草乌中含有的生物碱类化学成分变化较小,新增gallic acid,chebulic acid,shikimic acid等9种诃子中含有的化学成分,猜测诃子制草乌的减毒机制可能与诃子中化学成分有关。该研究结论表明药典法制草乌与诃子制草乌中化学成分有质的不同,二者具有不同的减毒原理。

诃子鞣酸对乌头碱致H9C2细胞损伤的保护作用及机制

目的通过研究诃子鞣酸对乌头碱致H9C2细胞损伤的保护作用,探讨蒙药诃子制草乌炮制减毒机制。方法以不同浓度的乌头碱、诃子鞣酸及乌头碱+诃子鞣酸分别作用于H9C2细胞,利用高内涵分析(HCA)技术检测并分析药物对H9C2细胞数量、细胞核面积、细胞核DNA含量、Ca^2+荧光强度及线粒体功能的影响。结果10、20μmol/L乌头碱作用于H9C2细胞24 h后,可导致细胞内Ca^2+超载;20μmol/L乌头碱可致H9C2细胞线粒体功能障碍;5、10、20μmol/L诃子鞣酸单独作用于H9C2细胞均无明显毒性;当10、20μmol/L诃子鞣酸与20μmol/L乌头碱共同作用于H9C2细胞24 h后,线粒体功能恢复,细胞内Ca^2+荧光强度降低;与对照组相比,无明显差异。结论乌头碱会引起H9C2细胞Ca^2+超载和线粒体功能障碍,可能是草乌致心肌细胞毒性的主要原因。诃子中的诃子鞣酸可明显抑制由乌头碱引起的Ca^2+超载,改善线粒体功能,起到解草乌毒的作用。