TC/IC-RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据GenBank上登录的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)外壳蛋白基因保守序列,设计特异性引物,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)和免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)技术对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行检测.结果表明,TC-RT-PCR和IC-RT-PCR均具有良好的特异性,检测灵敏度分别比DAS-ELISA高10和100倍;通过对一批进境黄瓜样品的检测,验证了2种检测技术的实际应用效果.因此,本研究建立的TC-RT-PCR和IC-RT-PCR检测技术,可有效应用于CGMMV的快速检测.

马铃薯PVY和PLRV病毒的TC-RT-PCR检测

传统的RT-PCR技术检测病毒需提取总RNA,RNA容易降解。利用试管捕捉反转录扩增(Tube cap-ture RT-PCR,TC-RT-PCR)方法检测了PVY和PLRV 2种病毒,实现了不需提取总RNA也可在同一反应中同时检测2种病毒。根据已报道的引物用TC-RT-PCR的方法对PVY和PLRV的外壳蛋白基因进行了检测。结果表明,TC-RT-PCR能够成功的检测出感染PVY或PLRV以及2种病毒共同侵染的样品,扩增产物序列长度均与设计片段的长度相符,分别为781和364 bp,2种病毒扩增产物的测序结果同Gene Bank中已知的序列比对后的同源性均高达97%以上。该技术为单独或复合感染的马铃薯病毒的检测提供了更加方便、高效的方法。同时测得试验PVY病毒样本属于PVYNW株系。

甜樱桃茎尖培养及PNRSV的RT-PCR检测

研究了茎尖大小、接种方式、培养基成分、试材基因型对甜樱桃品种茎尖培养的影响。 1年生成熟枝条上茎尖成苗率为 8.3%～ 2 3.7% ,嫩梢上的茎尖成苗率为 2 7.3%～ 37.5 %。利用RT PCR技术对部分甜樱桃试管苗进行了早期病毒鉴定 ,筛选出一些不带李坏死环斑病毒 (PNRSV)的甜樱桃试管苗 ,并证明甜樱桃试管苗微茎尖培养不能有效脱除PNRSV。

TC-RT-PCR技术在马铃薯病毒检测及其基因克隆上的应用

利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)技术从马铃薯病毒发病叶片中检测并克隆到PVX、PVY和PLRV3种病毒及其外壳蛋白基因的全长序列,长度分别为714、804和627 bp。结果表明,TC-RT-PCR技术是一种简单,快捷,灵敏度高的方法,在马铃薯病毒的检测和相关基因的克隆中将会得到很好的应用。

二重RT-PCR快速检测马铃薯病毒的方法

本研究采用传统的蛋白酶K法和病毒RNA简易浸提法,从马铃薯块茎、茎干、叶梗、叶片中提取马铃薯X病毒,马铃薯Y病毒,马铃薯A病毒及马铃薯卷叶病毒RNA ,并设计了4种马铃薯病毒引物,优化了二重RT PCR反应条件,可以同步扩增出上述4种病毒,扩增产生的靶带分别为562bp(PVX)、480bp(PVY)、3 3 6bp(PLRV)、2 55bp(PVA)。应用病毒RNA简易制样技术和优化的二重RT PCR反应条件,可以同步快速检测田间自然感染的马铃薯病毒,此研究还可适合于检测马铃薯脱毒种薯及试管苗,对马铃薯病毒病早期监测有一定的作用。

冬种马铃薯脱毒试管苗的培育技术研究

本研究针对惠州市冬种马铃薯出现卷叶病毒感染的现状,利用茎尖培养技术培养育脱毒的试管苗,并应用RT-PCR技术检测马铃薯试管苗的脱毒情况,为本地繁育种薯提供技术依据。

H5N1禽流感病毒微磁粒捕捉系统和SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

利用禽流感H1N1抗体包被微磁珠制备免疫磁珠,再通过抗原抗体反应得到了含有N1亚型的病毒,然后设计针对H5亚型的特异性引物,同时构建含有H5亚型HA基因部分序列的标准质粒,定量后作为模板,建立了可以检测H5亚型禽流感病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)方法。结果表明,制备的免疫磁珠可以吸附4个血凝单位的H5N1流感病毒和5个血凝单位的H1N1流感病毒,而对H9N2亚型流感病毒无特异性结合,从而可以富集N1亚型的流感病毒。H5亚型RRT-PCR检测灵敏度可达到4.6拷贝/μL,线性范围达5个数量级;特异性强,与NDV和H1、H9亚型禽流感病毒不发生交叉反应。因此,利用该方法可以很好地检测H5N1禽流感病毒。

红芽芋脱毒试管芋诱导及植株再生

为解决红芽芋脱毒苗移栽成活率低、种苗易分化等问题,以江西地方名优芋品种‘铅山红芽芋’为材料,开展茎尖脱毒、试管芋诱导及植株再生的研究。结果表明,芋芽剥取0.2~1.0 mm茎尖接种于MS+2.0 mg·L^(-1) 6-BA+0.5 mg·L^(-1) NAA+3%蔗糖培养基中可诱导成苗;通过RT-PCR分子检测,0.3 mm以下茎尖培养的试管苗中未发现芋花叶病毒(DsMV);脱毒苗继代增殖最佳诱导培养基为MS+3.0mg·L^(-1) 6-BA+0.5 mg·L^(-1) NAA+3%蔗糖,脱毒苗试管芋诱导的最佳培养基为MS+1.0 mg·L^(-1) 6-BA+0.5 mg·L^(-1) NAA+8%蔗糖,最佳培养条件为温度25℃,光照54μmol·m^(-2)·s^(-1),光周期14 h·d^(-1);脱毒试管芋的最佳移栽驯化基质为草炭︰蛭石=2︰1;脱毒试管芋移栽后,成活率达97.71%,生长中未出现分化现象。脱毒芋相比未脱毒芋增产43.14%,营养品质指标存在显著差异。脱毒试管芋的诱导形成及植株再生体系的建立为红芽芋健康种苗的快速繁殖提供了一条新途径。

苹果茎沟病毒部分分离物的生物学特性与分子鉴定

通过昆诺藜接种鉴定和 ELISA 检测,从梨和苹果上分离获得苹果茎沟病毒(Apple stem groo-ving virus,ASGV)23个分离物。采用 TC-RT-PCR 对这些分离物进行扩增,均获得特异的扩增片段,PCR 产物经5%PAGE 电泳,出现大小约500、530和600bp 的3种迁移率不同的泳动带型。根据PCR 产物电泳迁移率的差异,选取3个来源于梨的分离物 P-L4、P-6-1-17和 P-3-2-67的 PCR 产物进行克隆与序列测定。经 BLAST 搜索,3个分离物的扩增片段与苹果分离物 P-209的 CP 基因3′端核苷酸序列同源性分别为92.2%、90.4%和88.4%。3个分离物间的核苷酸序列也有较大差异,P-L4/P-6-1-17为95.5%、P-L4/P-3-2-67为90.4%、P-6-1-17/P-3-2-67为88.6%。