产腈水解酶基因工程菌的产酶诱导条件及培养基优化

本文通过对产酶诱导条件及发酵培养基进行优化,成功提高了产腈水解酶基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pETNYNit的产酶水平。研究结果显示,最佳发酵培养基为:葡萄糖0.2%、甘油0.7%(v/v)、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl0.3%、(NH_4)2SO_40.3%、NH_4Cl0.13%、Na2HPO_4·12H_2O1.04%、KH_2PO_40.39%、MgSO_4·7H_2O0.03%,pH7.2。最佳产酶诱导条件为:发酵4h时加入0.5mmol/LIPTG,然后在28℃、240r/min下诱导腈水解酶基因表达14h^16h。采用优化方案,重组菌产酶水平可提升至0.9~1×105U,与野生菌株的产酶水平相比,提高幅度超过50%。同时重组菌培养仅需24h,培养周期缩短超过50h。

屎肠球菌Ef2的安全性评估及其产生物胺氧化酶培养和诱导条件的优化

采用溶血实验、药敏实验、耐药基因和毒力基因PCR扩增对屎肠球菌Ef2进行安全性评估,实验结果表明,屎肠球菌Ef2溶血实验呈阴性,对庆大霉素、链霉素等不敏感,而对万古霉素等其他大部分抗生素抗菌药物敏感,无毒力基因检出,因此初步判定该菌株是安全的,可用作后续实验。通过单因素结合正交实验对该菌株产生物胺氧化酶的诱导培养基和培养条件进行优化,最后确定诱导培养基的最佳成分为:乳糖50 g/L、腐胺6 g/L、酵母膏8 g/L、MgSO_43 g/L、MnSO_40. 03 g/L、乙酸钠1. 5 g/L;最佳培养条件为:初始pH 7. 0、接种量0. 5%、培养时间36 h、培养温度32℃。生物胺氧化酶酶活力从诱导前的10. 9 U/mL提升至26. 12 U/mL,酶活力提高了139. 63%。研究结果表明,通过对培养和诱导条件的优化,可大幅度提升屎肠球菌Ef2产生物胺氧化酶的活力。

产胆固醇氧化酶重组大肠杆菌的发酵培养基和诱导条件的优化

在摇瓶中对产胆固醇氧化酶重组大肠杆菌的发酵培养基和诱导条件进行了优化,优化培养基为甘油10 g/L,胰蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,KH2PO42 g/L,K2HPO44 g/L,Na2HPO4.12 H2O7 g/L,(NH4)2SO41.2 g/L,NH4Cl 0.2 g/L,MgSO4.7 H2O1 g/L;优化的诱导条件为:对数生长中期诱导,IPTG浓度为0.3 mmol/L。在优化的培养基和优化的诱导条件下,单位菌体产酶量达745.86 U/g,菌体产酶水平达1 625.97 U/L,为优化前的700 U/L的2.3倍。

优化密码子及诱导温度提高雪白根霉脂肪酶在毕赤酵母中的表达

根据毕赤酵母密码子的偏好性,通过在线软件对雪白根霉脂肪酶基因(rnl)进行密码子优化。优化后的脂肪酶基因(rnl-opt)GC含量由原来的46%提高到49%,碱基A,T,C,G均匀分布,减少了AT和GC富集区,适应指数由0.82提升到0.85。将rnl-opt连接到表达载体p PICZαA并转入毕赤酵母X33中。将含有rnl和rnlopt的重组工程菌在摇瓶和50 L发酵罐中进行诱导表达。摇瓶培养条件下,含有rnl和rnl-opt重组工程菌的最大酶活分别为458、956 U/m L。50 L发酵罐培养条件下,含有rnl和rnl-opt重组工程菌的最大酶活和总蛋白浓度分别为14 856、30 500 U/m L和3.61、7.8 g/L。为了进一步提高含rnl-opt重组工程菌的表达酶活,对其在50L发酵罐培养的诱导温度进行优化,当诱导温度为22℃时,含rnl-opt重组工程菌的酶活和细胞湿重均达到最大值分别为39 520 U/m L和461 g/L。相对于30℃,酶活和细胞湿重分别提高了30%和16%。

致病性鸡大肠杆菌pilA和外膜蛋白C原核诱导表达条件的优化

分别从温度、接菌量、诱导时机、IPTG浓度、诱导时间等条件对2种重组菌株BL21/pET-28a-pilA和BL21/pET-28a-ompC进行优化.得到最佳诱导条件:BL21/pET-28a-pilA菌株为40℃摇培,80μL的接菌量,160 r/min摇培2 h后加入终浓度为0.96 mmol/L的IPTG,再诱导表达4 h,得到最高特异蛋白表达量;BL21/pET-28a-ompC菌株为37℃培养,80μL的接菌量,160 r/min摇培2.5 h后加入终浓度为0.64 mmol/L的IPTG,再诱导表达6 h,得到最高特异蛋白表达量.

略阳乌鸡ɑ干扰素原核表达载体构建及诱导条件优化

为了探索略阳乌鸡α干扰素在大肠杆菌中高效表达的诱导条件,试验采用PCR获得略阳乌鸡α干扰素成熟肽段的编码区DNA序列,将其克隆至载体p ET-32a的HindⅢ和XhoⅠ位点间,并通过菌落PCR和测序鉴定获得的鸡α干扰素的原核表达载体p ET-32a-Ch IFN-α。将p ET-32a-Ch IFN-α转化至大肠杆菌Rosetta菌株,通过筛选获得阳性克隆,进而分别对诱导表达时间、诱导剂浓度等条件进行筛选,获得了略阳乌鸡α干扰素的最佳表达条件。结果表明:成功构建p ET32aCh IFN-α质粒和重组菌株,最适诱导表达条件为诱导温度37℃,诱导剂IPTG浓度0.2 mmol/L,诱导时间5 h,诱导时机OD600值为0.448时。说明构建略阳乌鸡α干扰素的原核表达菌株成功,并且实现了α干扰素的高效表达。

绵羊肺腺瘤病毒受体Hyal-2原核表达诱导条件的优化及其表达产物的鉴定

为了提高绵羊肺腺瘤病毒受体透明质酸酶-2(Hyal-2)在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量,试验对含pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒的BL21(DE3)重组菌原核表达条件进行了优化。结果表明:诱导剂IPTG浓度、作用时间、温度对目的蛋白的表达影响很大,在37℃条件下加入不同终浓度的IPTG(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L)对重组菌诱导4 h,在终浓度为0.4 mmol/L时目的蛋白的表达量最高;加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,在37℃条件下诱导,在不同时间点(2,4,6,8小时)取样,在作用时间为2 h,37℃条件下表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在,当温度降低时可溶性形式明显增加。通过对诱导条件的优化和摸索发现,绵羊肺腺瘤病毒受体Hyal-2原核表达在诱导剂IPTG浓度为0.4 mmol/L、作用时间为2 h、温度为37℃时目的蛋白的表达量最高。

乳源性免疫活性肽在E.coli BL21中分泌表达的诱导条件优化

设计4个乳源性免疫活性肽的目的基因后,利用基因重组技术成功构建原核表达载体pTYB11,并将重组质粒转化到E.coli BL21中,通过改变异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的浓度、培养时间和培养温度,设计正交试验来优化乳源活性小肽的IPTG诱导表达条件,使目的蛋白可在E.coli BL21中高效表达。依据15%SDS-PAGE电泳分析得到融合蛋白的表达量,选出最适诱导条件为IPTG终浓度0.1～0.2mmol/L,在12～15℃条件下培养20h,得到大小为59.2kD左右的融合目的蛋白,其表达量可占总蛋白表达量的40%,经Western Blotting鉴定正确。

重组褐藻胶裂解酶表达体系的构建及诱导条件优化

目的对褐藻胶裂解酶基因aly-cob进行外源表达,并优化诱导条件以实现褐藻胶裂解酶的高效表达。方法以产褐藻胶裂解酶菌株Cobetia sp.WG-007为出发菌株,对克隆得到的褐藻胶裂解酶基因进行稀有密码子改造,构建重组质粒pET-28a(+)-aly-cob,在宿主Escherichia coli BL21pLysS中进行诱导表达,对发酵培养基、异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、诱导温度、诱导时机、诱导浓度及诱导时间进行系统优化以提高酶活。结果构建了重组菌E.coli BL21pLysS/pET-28a(+)?aly-cob,最适培养基为SB培养基,最佳诱导条件为OD600为1.0时加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG,在22℃下诱导24h后酶活可达2 403.93U/mL。结论成功对优化后的褐藻胶裂解酶基因aly-cob进行外源表达,经诱导表达条件优化后酶活为野生菌酶活的15倍,更具有工业化应用的潜力。

重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-S12表达头孢菌素酰化酶的诱导条件优化

头孢菌素酰化酶AcyⅡ可以直接水解CPC生成7-ACA,后者是重要的医药中间体,用来合成头孢类抗生素。头孢菌素酰化酶S12是AcyⅡ的突变体,其催化效率比AcyⅡ高。本文通过优化头孢菌素酰化酶S12在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达条件,为确定周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺奠定基础。利用单因素和正交设计对装液量、接种量、诱导时间,诱导温度和IPTG浓度等发酵条件进行了考察。单因素结果表明:装液量为25mL/250mL三角瓶,接种量1%,指数生长开始加入0.05mM IPTG,28℃诱导20小时发酵液酶活最高;正交试验结果表明:装液量50mL/250mL三角瓶,接种量2%,指数生长开始加入0.05mM IPTG,诱导28℃且诱导24hours酶活最高,发酵液产酶水平达639.9U/L。方差分析结果显示,发酵时间和装液量对酶活影响极显著,诱导时机对酶活影响显著,接种量对酶活没有显著影响。验证实验发现,发酵液产酶水平最高可以达到802.9U/L。本实验为该工程菌的发酵研究提供了最佳的表达诱导条件,对下一步的研究具有指导意义。

重组亚油酸异构酶诱导表达条件的优化

为了提高重组亚油酸异构酶的活力,试验对重组亚油酸异构酶诱导表达过程中的诱导时机、诱导时间、诱导剂浓度和诱导温度4个影响因素进行了研究,并进行了优化。正交试验表明,最佳诱导条件为:诱导时机为诱导前培养菌体7 h,诱导时间为10 h,诱导剂浓度为0.15 mM,诱导温度为30℃。最佳诱导条件下,诱导出的亚油酸异构酶的酶活力平均可达3 849.686 0 U/ml。结果显示,通过对诱导条件进行优化所得的亚油酸异构酶具有较高的酶活力。

优化全麻诱导用药预防患者芬太尼呛咳反应的观察

目的:探讨优化全麻诱导用药预防患者芬太尼呛咳反应情况.方法:随机选取我院收治的需要实施全麻诱导的患者100例,分为观察组(n=50)和对照组(n=50).对照组患者使用常规的方法实施麻醉诱导,观察组患者使用优化全麻诱导的方式进行麻醉诱导.结果:观察组患者的咳呛率明显低于对照组,同时观察组患者在临床上的咳呛严重程度明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论:对需要实施麻醉诱导的患者在临床进行麻醉的过程中,对患者实施分次注射芬太尼的优化全麻诱导,并不会影响对患者的插管反应的抑制,同时也能够明显降低患者在临床上的咳呛率以及咳呛强度,值得推广应用.

隧道入口接近段主动诱导设施设置优化技术

为进一步提高隧道入口行车安全,有效预防事故发生,从驾驶表现、视觉感知和心理状态3个方面对隧道入口诱导设施评价体系进行分析。选取方向盘修正频率、视点水平角度15%~85%范围和皮电升高起点作为评价指标,基于多级诱导的原则,设计了4种诱导设施试验方案。采用驾驶模拟试验研究了隧道入口诱导设施的有无、形状、间距、高度对驾驶人驾驶行为的影响,进而形成了隧道入口接近段主动诱导设施设置优化技术。结果表明:诱导设施可提前将驾驶人视点集中于隧道入口,帮助驾驶人对隧道入口的认知信息进行加工,提高驾驶人在隧道入口前的横向操控能力,降低事故率;不同形状诱导设施对驾驶人影响不同,其中圆弧式诱导设施诱导效果比圆柱式好,因为圆弧式诱导标更接近于隧道口的形状,可使驾驶人提前感知隧道入口,增强驾驶人对隧道入口的视觉关注度;诱导设施设置间距4 m和8 m时均可发挥诱导设施的作用,但高速行驶下4 m设置间距会导致诱导设施出现重叠,考虑经济性和可行性,8 m为最佳设置间距;相对于高度不变的设置方式,诱导设施逐渐加高对驾驶人的诱导效果更佳,可实现诱导设施与隧道入口立面标记连续的效果,使驾驶人的视线集中在隧道入口,实现早诱导、强诱导的效果。

优化全麻诱导用药预防患者芬太尼呛咳反应的观察

目的:观察优化全麻诱导用药在预防患者芬太尼呛咳反应中的应用价值。方法:选取2016年4月-2017年10月笔者所在医院接诊且需行全麻诱导的患者92例,采用奇偶数字分组法将其分成试验组和对照组,每组46例,试验组实行优化全麻诱导,对照组实行常规麻醉诱导,综合分析两组呛咳反应的发生情况,并对其进行比较。结果:试验组的呛咳反应发生率为10.87%,明显低于对照组的39.13%,比较差异有统计性意义(P<0.05);试验组呛咳反应的严重程度明显轻于对照组,比较差异有统计性意义(P<0.05)。结论:应用优化全麻诱导方案,可有效降低患者发生芬太尼呛咳反应的发生率,并有助于减轻患者呛咳反应的严重程度。

雨生红球藻培养基筛选及诱导条件优化

目的:本文通过筛选有利于雨生红球藻营养生长的培养基,优化雨生红球藻内虾青素的积累条件。方法:选用7种培养基对4株雨生红球藻分别进行培养,同时筛选出最适于4种藻株营养生长的培养基。探究雨生红球藻在光胁迫、缺氧、高盐3种条件下诱导虾青素积累情况。结果:4个不同雨生红球藻藻株在配方A培养基中的生物量比其他6种试验培养基的生物量高1.54-6.29倍;在优势培养基配方A中,HP 3的生物量最大,可达到6.03×106个/mL;HP 3在缺氮的胁迫条件下,虾青素产量最高,可达到20.96mg/L,比光诱导获得的最佳虾青素产量高0.96倍,比高盐获得的最佳虾青素产量高1.53倍。结论:该研究中最适于试验藻株营养生长的培养基是配方A,当胁迫条件为缺氮9%时虾青素积累量最大。

重组大肠杆菌产谷氨酰胺转氨酶培养基及发酵条件优化

对已构建好的表达谷氨酰胺转氨酶的大肠杆菌Rosetta DE3的摇瓶培养条件及发酵条件进行优化,所获优化培养基配方为葡萄糖4.0g/L,酵母膏3.0g/L,NH4Cl 4.0g/L,Na2HPO42.0g/L,K2HPO41.0g/L,MgSO4.7H2O 1.0g/L,NaCl 3.0g/L。得菌株发酵培养的最佳优化条件为装液量为25mL,接种量为5%,加IPTG浓度为0.6mmol/L,诱导时间为4h。

南方红豆杉愈伤组织诱导研究

文章研究了从南方红豆杉的幼叶及幼茎,在MS、B5、N6及SH4种培养基上的诱导愈伤组织的情况,并对愈伤组织的诱导条件进行优化,结果表明以幼叶及幼茎作为外植体在MS培养基上产生愈伤组织的速度较快,7d即有愈伤组织发生,但愈伤组织也容易褐化;而B5和N6培养基愈伤组织机构紧密,褐化少。不同部位外植体诱导愈伤组织有差异,茎、叶容易诱导愈伤组织,根的诱导率差。外植体大小对于愈伤组织影响显著,带有部分叶的茎段不能够形成愈伤组织,带有根的茎段则可以诱导愈伤组织。

重组毕赤酵母产猪IFNα的诱导条件

采用Plackett-Burman实验设计,选取甲醇、酵母粉、蛋白胨、K2HPO4.12H2O、MgSO4、(NH4)2SO4、pH和PTM1这8个对重组猪IFNα表达量有影响的相关因子进行筛选,用SAS软件进行统计分析,分析表明:甲醇、蛋白胨以及K2HPO4.12H2O对重组猪IFNα表达量具有显著性影响;之后采用Box-Behnken设计及响应面分析法确定最佳的诱导条件。在最优条件下,重组猪IFNα表达量比优化前提高了2.46倍。

重组大肠杆菌表达β-甘露聚糖酶的条件优化

目的:优化重组大肠杆菌表达β-甘露聚糖酶的条件;方法:利用单因素试验和正交试验,确定重组β-甘露聚糖酶表达的诱导温度、时间及p H;结果:最佳产酶条件为;诱导温度60℃,诱导时间7h,p H6.0。结论:表达优化条件稳定性好,可为后续的工业化生产奠定基础。

大肠杆菌表达腺苷蛋氨酸合酶及产酶条件优化

腺苷蛋氨酸(adenosymethionine,SAM)是人体中重要的代谢中间体,在医疗上被广泛应用于治疗肝炎,抑郁症以及关节炎等疾病。酶法进行腺苷蛋氨酸的生产具有良好的工业前景。将来源于酿酒酵母BY4741中的腺苷蛋氨酸合酶基因(sam2)进行密码子优化后,与p ET-28a(+)和p ET-3b(+)进行连接获得重组质粒p ET-28a(+)-sam2和p ET-3b(+)-sam2,分别实现其在E. coli BL21(DE3)和E. coli Rosetta(DE3)中的异源表达,结果表明,重组菌E. coli BL21/p ET-28a(+)-sam2的SAM酶活较高,达到0. 184 U/m L。对该重组菌株进行发酵条件优化,在最优条件下,SAM合酶最高酶活为0. 245 U/m L,比优化前提高34%。