真核基因重组Sox2及其在小鼠角膜基质细胞中的表达

目的基因重组构建具有穿膜活性的核转录因子Sox2真核表达系统,将其转染至小鼠角膜基质细胞,检测其在小鼠角膜基质细胞中的表达。方法利用重叠延伸PCR法重组目的基因Sox2-PTD构建质粒,测序检测重组DNA序列是否克隆正确。确定正确序列后将其转染至小鼠角膜基质细胞。倒置显微镜下观察细胞生长情况,转染后约10d免疫荧光化学鉴定其表达。结果成功构建质粒PCDNA3.1-Sox2-PTD;4个转录因子测序结果显示:Sox2基因测序结果与基因模板序列100%一致;成功转染至小鼠角膜基质细胞中;荧光显微镜下观察可见,Sox2-PTD在细胞浆和细胞核内均有表达,主要分布在细胞核内。结论成功构建核转录因子的真核表达系统,可转染至小鼠角膜基质细胞并引起细胞形态和表型的变化,为真核重组外源蛋白诱导角膜基质细胞转化为多能干细胞奠定基础。

带有穿膜肽PTD的重组Oct4的制备及活性鉴定

目的:重组蛋白构建细胞转录因子PTD-Oct4。方法:利用重叠延伸PCR法重组目的基因构建质粒pKYB-PTD-Oct4,并转染至E.coli ER2566。镍柱纯化重组蛋白并用Western bloting对其进行鉴定。用异硫氰酸荧光素(FITC)标记PTD-Oct4,检测其穿透中国仓鼠卵巢(CHO)细胞膜的能力;用荧光共振能量转移(FRET)检测重组融合蛋白PTD-Oct4结合目的DNA的活性。结果:成功获得目的蛋白PTD-Oct4,其可以成功进入细胞,定位于细胞核内,穿膜效率为(28.3±2.4)%,并具有与目标DNA序列特异结合的能力。结论:制备重组PTD-Oct4为外源蛋白诱导多能干细胞(IPSCs)奠定基础。