T细胞可诱导共刺激分子配体胞外段基因的克隆与表达

目的:克隆T细胞可诱导共刺激分子配体胞外段(ICOSL-N)基因,构建pET22b-ICOSL-N-Ig原核表达载体,实现ICOSL-N与IgG4体外融合表达。方法:设计并合成T细胞ICOSL-N和IgG4基因特异性引物,RT-PCR法从小鼠脾脏中克隆出ICOSL-N,PCR重叠延伸技术将ICOSL-N与IgG4基因融合,构建原核表达载体pET22b-ICOSL-N-Ig,转化E.coli BL21(DE3)工程菌,筛选鉴定阳性克隆,IPTG诱导阳性重组子,SDS-PAGE法鉴定融合蛋白ICOSL-N-Ig的表达。结果:融合基因ICOSL-N-Ig的PCR扩增产物大小约1425 bp,符合理论值;原核表达载体pET22b-ICOSL-N-Ig经酶切、PCR和测序鉴定结果符合预期;在诱导后的菌体中检测出大小为53800的蛋白诱导条带,且与目标蛋白的大小一致。结论:成功克隆ICOSL-N基因,实现ICOSL-N在E.coli BL21(DE3)工程菌中与IgG4的融合表达。

转染小鼠可诱导共刺激分子配体基因细胞株的构建及其对T细胞体外活化与增殖的促进作用

目的构建转染小鼠可诱导共刺激分子配体（ICOSL）基因的中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞株（CHO／ICOSL），探讨其对T细胞体外增殖与活化的促进作用。方法从小鼠脾脏细胞中抽提总RNA，采用RT—PCR的方法获得小鼠ICOSL基因，经EcoRI、BamHI双酶切后装入EGFP—plRES2真核表达载体中并测序鉴定，用脂质体转染技术将重组载体EGFP—plRES2／ICOSL转染CHO细胞，经G418加压筛选，流式细胞术和RT—PCR分析其在CHO细胞中的表达。以转染空载体CHO细胞（CHO／Mock）作为对照，将CHO／ICOSL细胞与T细胞体外共培养，通过检测活化T细胞上CD25、CD69的表达及T细胞增殖实验对小鼠／COSL转基因细胞的生物学功能进行初步研究。结果CHO／ICOSL基因转染细胞能稳定地高表达小鼠ICOSL分子。与CHO／Mock相比，CHO／ICOSL基因转染细胞能够显著促进T细胞的体外活化与增殖（P〈0．05）。结论成功构建稳定表达小鼠／COSL的基因转染细胞株，该细胞株能显著促进T细胞的体外活化与增殖，为进一步深入研究该分子生物学功能奠定了基础。

诱导共刺激分子和诱导共刺激分子配体在系统性红斑狼疮患者外周血中表达的变化及临床意义

目的 检测SLE患者外周血淋巴细胞表面诱导共刺激分子（ICOS）和诱导共刺激分子配体（ICOSL）的表达,以及血浆中可溶性ICOSL的表达,探讨其临床意义.方法 流式细胞术检测45例SLE患者和39名健康志愿者外周血CD4＋、CD8＋T细胞表面ICOS及CD14＋单核细胞、CD19＋B细胞表面ICOSL的表达;ELISA检测血浆可溶性ICOSL的表达,分析临床意义.采用Levene方差齐性检验,组间比较采用t检验,两变量间相关性采用Pearson相关分析.结果 与健康志愿者相比,SLE患者外周血CD4＋、CD8＋T细胞表面ICOS的表达均显著升高[（19.1±1.7）％与（14.0±1.5）％,t=2.156,P=0.035]、[（10.0±1.0）％与（6.4±1.0）％,t=2.587,P=0.012].CD14＋单核细胞上ICOSL的表达高于健康志愿者个体[（2.94±0.88）％与（0.89±0.21）％,t=2.152,P=0.04],且与患者血浆C3、C4水平呈正相关（r=0.401,P=0.031;r=0.44,P=0.017）.活动期组SLE患者血浆sICOSL的浓度显著高于非活动期组[（362±25） ng/ml与（278±15） ng/ml,t=2.356,P=0.025],且与CD14＋单核细胞和CD19＋B细胞表面ICOSL的表达均呈负相关（r=-0.4243,P=0.022;r=-0.4099,P=0.025）.MMPI可显著抑制sICOSL产生.结论 SLE患者外周血淋巴细胞表面ICOS和ICOSL,以及血浆sICOSL异常表达,且与疾病活动度密切相关.提示ICOS/ICOSL信号通路可能参与SLE免疫病理进程.

可诱导共刺激分子配体的研究进展

可诱导共刺激分子配体(ICOSL)及其受体可诱导共刺激分子(ICOS)在免疫应答和调节中发挥重要作用。ICOSL参与T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化,诱导Th1细胞和Th2细胞的细胞因子产生,ICOS/ICOSL共刺激通路在炎症反应性疾病及肿瘤相关疾病中起重要作用。本文对ICOSL的研究进展进行综述,以期提高对多种免疫相关性疾病的认识。

可诱导共刺激分子及其配体在系统性红斑狼疮发病及治疗中的作用

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种复杂的自身免疫性疾病,其特征是免疫耐受性丧失和免疫细胞过度活跃,共同导致多器官多系统中自身抗体的产生和抗体引起的组织损伤,其多器官、多系统损害与T细胞活化、B细胞增殖及炎症因子异常密不可分[1-2]。T细胞活化需要两个不同信号,其中共刺激信号是T细胞活化所需的第二信号[3]。CD28/B7家族是最基础的共刺激信号。研究表明,其对T细胞活化、B细胞增殖、分化及细胞因子分泌发挥重要作用[4],阻断CD28/B7信号通路对SLE模型病理损害有缓解和逆转作用[5],其他共刺激分子在免疫系统相关疾病中的重要作用也已被证实[6-7]。

共刺激分子(ICOS)及其特异性配体(ICOSL)在骨性关节炎滑膜组织中的表达及其临床意义研究

目的研究共刺激分子(ICOS)及其特异性配体(ICOSL)在膝关节骨性关节炎(OA)滑膜组织中的表达及其临床意义。方法分别采集14例OA轻度及18例OA重度患者滑膜病变部位和远离病变部位,经HE染色法观察其病理改变,免疫组织化学法检测滑膜组织中ICOS、ICOSL的表达情况。结果 OA轻度患病组和重度患病组滑膜组织病变部位出现明显的炎性改变。ICOS、ICOSL在OA患者病变滑膜组织中高表达,且重度患病组表达最高。结论 ICOS、ICOSL共刺激分子在OA患者病变滑膜组织中高表达,对炎症反应的免疫紊乱和免疫损伤发挥重要作用。

ICOS-ICOSL共刺激通路及其功能的研究进展

可诱导共刺激分子 (ICOS)和可诱导共刺激分子配体 (ICOSL)分别是CD2 8家族与B7家族的新成员。ICOS ICOSL共刺激信号对细胞免疫和体液免疫起调节作用。ICOS ICOSL共刺激通路可以增强CD2 8/B7 1/B7 2的共刺激信号的效应功能 ,诱导Th1和Th2细胞因子的产生 ,并在T细胞依赖的B细胞的活化中起重要作用。调控ICOS ICOSL共刺激通路可望成为多种疾病免疫治疗的一种新途径。

COPD合并肺源性心脏病患者血清ICOS、ICOSL水平变化及临床意义

目的观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并肺源性心脏病(PHD)患者血清诱导性共刺激分子(ICOS)和诱导性共刺激分子配体(ICOSL)水平变化及临床意义。方法选择2020年6月—2023年2月上海交通大学医学院苏州九龙医院心内科收治COPD患者172例,根据患者是否合并PHD分为合并PHD组82例和COPD组90例。根据肺动脉收缩压(PASP)将PHD患者分为轻度亚组(30~50 mmHg,21例)、中度亚组(51~70 mmHg,37例)和重度亚组(≥71 mmHg,24例),再根据纽约心脏病协会(NYHA)分级将PHD患者分为Ⅰ~Ⅱ级亚组(44例)、Ⅲ~Ⅳ级亚组(38例)。酶联免疫吸附试验检测血清ICOS、ICOSL水平,分析ICOS、ICOSL与PASP、NYHA分级之间的相关性,受试者工作特征(ROC)曲线分析ICOS、ICOSL诊断COPD合并PHD的价值。结果合并PHD组血清ICOS、ICOSL水平高于COPD组(t=14.526、34.508,P均<0.001)。重度亚组血清ICOS、ICOSL及PASP水平高于中度亚组和轻度亚组(F/P=125.351/<0.001、163.591/<0.001、84.292/<0.001),Ⅲ~Ⅳ级亚组血清ICOS、ICOSL水平均高于Ⅰ~Ⅱ级亚组(t/P=11.658/<0.001、27.345/<0.001)。PHD患者血清ICOS、ICOSL水平与PASP、NYHA分级均呈正相关(r=0.439、0.416、0.501、0.497,P均<0.001)。血清ICOS、ICOSL及二者诊断COPD患者合并PHD的曲线下面积分别为0.780、0.723、0.926,二者联合高于单独ICOS、ICOSL诊断(Z=4.021、5.194,P均<0.001)。结论COPD合并PHD患者血清ICOS、ICOSL水平显著增高,且与肺动脉高压以及心功能降低有关,联合检测ICOS、ICOSL可有效评估COPD患者PHD风险。

ICOSL单克隆抗体对BXSB狼疮鼠病变的影响

目的观察大鼠抗小鼠ICOSL多克隆抗体抑制ICOS(可诱导共刺激分子)信号通路对BXSB狼疮鼠病变的影响。方法大鼠抗小鼠ICOSL(可诱导共刺激分子配体)抗体尾静脉注射BXSB狼疮鼠,100μg/次,3次/周,共4周,对照组以相同量PBS注射,在治疗后观察血IgG型dsDNA抗体、尿蛋白、肾小球IgG沉积以及肾组织病理变化。结果实验组狼疮鼠的蛋白尿和IgG型dsDNA抗体较对照组明显减少(P<0.01),IgG在肾组织沉积以及肾组织病理损伤也较对照组减轻(P<0.01)。结论抑制ICOS信号通路可减轻BXSB狼疮鼠病变。

ICOS在健康人外周血调节性T细胞上的生物学特征初探

目的:研究ICOS在健康人外周血Treg离体培养中的作用,了解m TOR对离体培养Treg ICOS表达的调控。方法:MACS分选Treg后经anti-CD3+anti-CD28磁珠刺激后第3、7天流式检测Treg表面ICOS表达情况;anti-CD3+anti-CD28抗体或anti-CD3+ICOSL-Fc刺激3 d,流式检测Treg ICOS表达情况;雷帕霉素处理离体培养Treg,流式分析其对Treg ICOS表达作用。CFSE标记人PBMC细胞,并与离体培养Treg混合培养,流式检测Treg的接触抑制活性。结果:anti-CD3+anti-CD28磁珠刺激Treg 3 d,ICOS+Treg中活、死细胞的比例分别为(92.00±2.69)%和(2.20±0.56)%,在ICOS-Treg中比例为(90.30±3.53)%和(1.77±0.78)%,两者无显著差异;培养第7天,ICOS+Treg细胞比例从第3天(40.20±1.83)%降至(11.60±1.10)%;anti-CD3+ICOSL-FC刺激Treg 3 d后,ICOS MFI为(403.30±74.42),anti-CD3+anti-CD28刺激组为(2 410.0±746.4),anti-CD3+ICOSL-FC刺激后Treg ICOS表达相比anti-CD3+anti-CD28组显著下降;雷帕霉素处理离体培养Treg细胞3 d后,ICOS表达下调。此外,雷帕霉素处理的离体培养Treg均能有效抑制PBMC中Tcon的分裂增殖。结论:ICOS表达高低对人外周血Treg存活率影响无显著差异,m TOR信号并非调控人Treg离体培养ICOS表达的唯一因素,CD28协同信号对调控离体培养人Treg。表达比ICOSL信号更为重要,雷帕霉素处理的离体培养人Treg仍具有细胞接触抑制活性。

慢性乙型病毒性肝炎患者外周血单个核细胞ICOS/ICOSL水平升高并与病情相关

目的检测慢性乙型肝炎(CHB)患者不同阶段外周血单个核细胞(PBMC)中诱导性共刺激分子(ICOS)及诱导性共刺激分子配体(ICOSL)mRNA的水平,并探索其临床意义。方法收集80例CHB患者以及20例健康对照者(HC)的外周血,检测血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)、HBV血清标志物乙型肝炎病毒表面抗原(HBs Ag)、乙型肝炎病毒e抗原(HBe Ag)和HBV DNA定量;采用实时荧光定量PCR检测PBMC中的ICOS、ICOSL mRNA的水平。结果与正常对照相比,HBeAg^+和HBeAg^-患者ICOS、ICOSL的mRNA水平均明显升高,但HBe Ag+和HBe Ag-患者间无显著差异。根据其血清ALT、HBsAg、HBeAg和HBV DNA定量结果将CHB患者其分为免疫耐受期、免疫活跃期、免疫低复制期、HBe Ag阴性慢性肝炎期,分析其结果发现免疫活跃期ICOS和ICOSL的mRNA水平较其他各期明显增加。结论 CHB患者PBMC中ICOS和ICOSL的mRNA水平升高,且与疾病活动度和病程相关。

Graves病外周血CD4^(+)T细胞ICOS及CD19^(+)B细胞ICOSL高表达且与促甲状腺素受体抗体(TRAb)水平正相关

目的探索诱导性共刺激分子及配体(ICOS/ICOSL)在Graves病(GD)外周血淋巴细胞上的表达及临床意义。方法募集105例初发未治疗的GD甲亢患者纳入初发GD甲亢组,匹配同时期性别、年龄无差异的健康对照组67例。其中初发GD甲亢组有19例患者接受抗甲状腺药物治疗并在门诊规律随访直至TRAb转阴,以动态观察ICOS、ICOSL在治疗前后的变化。分离初发GD甲亢患者外周血单个核细胞(PBMC),PCR检测PBMC上ICOS、ICOSL mRNA的表达;流式细胞术分别检测CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞亚群表面ICOS及CD19^(+)B淋巴细胞表面ICOSL的表达,分析其与甲状腺功能及促甲状腺素受体抗体(TRAb)水平的相关性。动态观察GD甲亢患者治疗前后ICOS、ICOSL表达的变化。结果与健康对照组相比,初发GD甲亢组PBMC上ICOS及ICOSL mRNA表达水平均显著增加。初发GD甲亢组CD4^(+)T细胞表面ICOS表达水平升高,且与游离甲状腺三碘原氨酸(FT3)水平显著正相关;TRAb高滴度组CD19+B细胞表面ICOSL表达水平显著高于TRAb低滴度组;GD甲亢患者TRAb转阴后,CD4^(+)T细胞表面ICOS及CD19+B细胞表面ICOSL的表达水平较初发时显著下降。结论Graves病患者外周血CD4^(+)T细胞表面ICOS及CD19+B细胞表面ICOSL表达水平显著升高;随着TRAb水平降低,CD4^(+)T细胞表面ICOS及CD19+B细胞表面ICOSL表达水平有所恢复。

系统性红斑狼疮患者血清B7-H4、ICOSL水平变化及与IKKβ/NF-κB通路的关系

目的 探讨系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)患者血清可溶性共刺激因子B7同源体-4(B7 nomolog 4,B7-H4)、外周血淋巴细胞表面诱导共刺激分子配体(inducible costimulator ligand, ICOSL)的表达水平与核因子KappaB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路中IκB激酶(IκB-kinase, IKK)β间的关系。方法 将2020年4月至2021年12月50例SLE患者纳入研究组,选取同期来某院一般体检的50例健康人作为对照组,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清B7-H4及诱导性共刺激分子配体(inducible costimulator ligand, ICOSL)表达水平,反转录聚合酶链反应(reverse tran-scription PCR,RT-PCR)法检测NF-κB通路中IKKβ mRNA表达水平。组间比较采用t检验,两两变量的相关性采用Pearson分析,绘制受试者操作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线分析联合B7-H4、ICOSL、IKKβ检测对SLE患者的诊断价值。结果 研究组血清可溶性B7-H4、ICOSL表达水平高于对照组,差异有统计学意义(t=-4.281、-31.439,P<0.05);研究组血清IKKβ mRNA表达水平高于对照组,差异有统计学意义(t=-5.256,P<0.05);Pearson相关系数显示B7-H4、ICOSL与IKKβ mRNA均存在显著正相关关系(r=0.782、0.766,P<0.05);ROC曲线显示联合检测诊断SLE曲线下面积为0.855,显著高于任意单一检测(Z=3.412,P<0.001),特异度为83.20%,敏感度为89.40%,有较高诊断效能。结论 SLE患者体内存在B7-H4、ICOSL和IKKβ mRNA高表达,3者呈正相关关系,实时检测B7-H4、ICOSL水平能准确评估疾病发展,对改善患者预后及抑制该病进展有重要意义。