细胞生长因子联合诱导ES细胞向肾脏前体细胞分化的实验研究

目的:探讨细胞生长因子联合诱导胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)向肾脏前体细胞定向分化的实验技术,为应用胚胎干细胞进行肾脏再生提供实验基础。方法:小鼠ES细胞悬浮培养2d制备成拟胚体,RA、activin-A、Bmp7三种生长因子诱导培养5d设为A组,不加生长因子培养设为对照(B组),生长因子培养5天后继续以肾脏上皮细胞生长培养液培养7d设为C组,免疫荧光检测Pax2、Bry、WT1蛋白表达情况,流式细胞技术检测Pax2、Bry、CD24阳性细胞比例,realtimePCR检测Pax2、Bry、Osr1、Lim1、WT1、Six2、Sall1、AQP1、CD24、PDGFR基因表达情况。结果:免疫荧光染色结果显示A组细胞Pax2、Bry、WT1的表达明显高于B组;流式细胞技术检测显示A组Pax2、Bry、CD24阳性细胞比例较B组增加,C组表达Pax2、Bry的阳性细胞比例较A组明显升高;realtimePCR检测显示A组Pax2、Bry、Osr1、Lim1、WT1表达较B组明显增加(P<0.05或P<0.01),C组表达CD24基因较A组明显升高(P<0.05)。结论:胚胎干细胞在体外生长因子联合诱导条件下能够分化为早期肾脏前体细胞,并表达部分成熟肾脏细胞的标记物。

成纤维细胞向神经细胞转分化的研究进展

自从将一种成体细胞转化为另一类型的成体细胞技术的出现,成纤维细胞转分化为神经细胞技术在神经系统领域迅速发展及为神经系统疾病损伤的修复带来了希望。本文就近几年由成纤维细胞直接或间接诱导转化为各神经功能神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、施旺细胞等重要研究成果做一归纳和总结,并对其前景进行展望。

兴奋性hiPSC源性类神经网络组织的构建

【目的】将人诱导多能干细胞源性神经前体细胞(hiPSC-NPCs)种植于去细胞视神经(DON)上,在体外构建一种具有突触传递功能的类神经网络组织,为神经组织损伤的修复提供一种有效途径。【方法】通过定向诱导和组织工程技术,联合应用hiPSCs和3D DON支架,构建一种新的类神经网络组织。定向诱导人诱导多能干细胞(hiPSCs)向人神经前体细胞(hNPCs)及神经元方向分化,使用免疫荧光染色鉴定细胞分化效率。制备3D DON支架,借助扫描电镜、Tunnel染色,鉴定支架形貌及细胞相容性。将诱导的hiPSC-NPCs种植于DON支架中,借助免疫荧光染色、扫描电镜、透射电镜和膜片钳对构建的类神经网络组织进行形态学观察和功能学鉴定。【结果】①免疫细胞化学染色结果提示,诱导的hiPSC-NPCs在体外大部分向神经元方向分化,成功构建了一种以神经元为主的神经网络。②扫描电镜和免疫组织化学结果提示,在体外成功构建了一种以兴奋性神经元为主的类神经网络组织。③免疫组织化学染色、透射电镜和膜片钳结果提示,构建的类神经网络组织能够传递兴奋性突触信息。【结论】利用天然来源的具有均匀孔道分布的DON生物支架材料和hiPSC-NPCs的有机结合,构建了一种以兴奋性神经元为主的具有突触传递功能的类神经网络组织,这种神经网络可作为脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)等神经组织损伤后组织替换疗法的有利工具,具有广阔的临床应用前景。

利用hiPSC-CPCs结合纤维蛋白凝胶构建3D心肌微组织

目的利用人诱导多能干细胞来源心肌前体细胞(Human induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitor cells,hiPSCs-CPCs)结合纤维蛋白凝胶构建3D心肌微组织用于研究心脏发育及药物筛选。方法首先利用化学分化法获得hiPSC-CPCs,并对其进行鉴定,然后将其混于纤维蛋白凝胶构建3D微组织,待hiPSC-CPCs分化成心肌细胞后获得心肌微组织;观察心肌微组织随培养时间延长的形态变化;分别于第15天和第30天对心肌微组织进行冰冻切片,使用免疫荧光对获得的心肌微组织进行心肌鉴定,并统计分析心肌微组织中心肌细胞的肌节长度、Z带宽度和排列情况;使用钙成像技术检测第15天和第30天心肌微组织的钙信号变化;使用MUSCLEMOTION ImageJ macro插件分析第15天和第30天的心肌微组织的收缩情况,并利用该软件检测心肌微组织对药物的反应。结果使用化学分化法可高效分化获得hiPSC-CPCs,将其与纤维蛋白凝胶结合可成功构建3D微组织,且该微组织培养至第10天可成功获得具有自发跳动能力的心肌微组织,继续培养至第30天,心肌微组织形态仍可维持,未出现溶解情况;免疫荧光结果显示,心肌微组织可高表达心肌标志物c Tn T和α-actinin,随着培养时间延长,肌节更趋于成熟状态;钙成像结果显示,可顺利检测到心肌微组织的钙信号变化,且随着培养时间延长,钙信号变化一致性明显提升;MUSCLEMOTION ImageJ macro结果显示,随着培养时间延长,心肌微组织收缩频率降低、收缩幅度增强,且异丙肾上腺素能成功激动心肌微组织,且随培养时间的延长,心肌微组织对异丙肾上腺素的反应更加灵敏。结论将hiPSC-CPCs混于纤维蛋白凝胶中可成功构建可持续培养的3D心肌微组织,其钙信号及收缩易于检测,且对药物反应敏感,有望成为研究心脏发育和药物筛选的有利工具。