谷氨酸棒状杆菌新型诱导启动子的研究

以丰富和完善谷氨酸棒状杆菌的表达元件、筛选适合工业化应用的新型诱导启动子为研究目标,借助绿色荧光蛋白GFP为报告基因,构建启动子筛选工具质粒,在谷氨酸棒杆菌中表达,筛选出三种高效表达的诱导启动子.通过检测绿色荧光蛋白表达强度可知:丙酸启动子诱导表达强度最大,葡萄糖酸启动子次之,蔗糖启动子较弱;丙酸启动子最适诱导浓度为60 ug/m L、葡萄糖酸启动子2 mg/m L、蔗糖启动子2 mg/m L,表达强度比无诱导对照组分别增加4.39、3.86、2.74倍.

植物逆境诱导启动子mwcs120的克隆及表达特性研究

以小麦基因组DNA为模板,通过特异PCR扩增,克隆逆境诱导表达启动子mwcs120。序列分析表明,该启动子与冷诱导启动子wcs120的序列同源性为97.1%,有2个位点发生了突变,但逆境调控保守元件的序列未发生改变。瞬时表达实验表明,在单子叶和双子叶植物中,mwcs120启动子均受低温和高盐逆境诱导,使GUS基因的表达增强。因此,mwcs120启动子在作物抗逆基因工程中具有较好的应用前景。

放射诱导启动子的合成与鉴定及质粒pcDNA3.1(+)/E-CDglyTK的构建

【目的】合成放射诱导启动子序列并构建其调控双自杀基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/E-CDglyTK。【方法】利用人工寡核苷酸片段合成放射诱导启动子,以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因转染Tca8113细胞,经流式细胞仪鉴定其辐射诱导特性。将pCEA-CDglyTK中双自杀基因CDglyTK亚克隆到pcDNA3.1(+),然后把合成启动子插入到CDglyTK上游构建质粒pcDNA3.1(+)/E-CDglyTK并酶切鉴定,阳离子脂质体介导其转染舌鳞癌Tca8113细胞,RT-PCR观察CDglyTK表达及诱导放疗的增效作用。【结果】合成启动子序列分析与设计序列完全一致;低剂量放射线照射可诱导这种人工启动子增强GFP在Tca8113细胞中的表达;重组质粒的酶切图谱与预期一致;3Gy放疗显著增强CDglyTK在Tca8113细胞中的表达。【结论】成功合成放射诱导启动子并构建由其调控双自杀基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/E-CDglyTK,为进一步研究肿瘤放射-基因治疗奠定了基础。

放射诱导启动子介导CDglyTK基因治疗Tca8113细胞的实验研究

目的观察人工放射诱导启动子介导CDglyTK双自杀融合基因治疗Tca8113细胞的疗效,为舌鳞癌治疗探索新的途径。方法构建人工放射诱导启动子调控双融合自杀基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/E-CDglyTK,用脂质体为载体转染Tca8113细胞后予以3Gy诱导放疗,描绘细胞生长曲线,RT-PCR检测CDglyTK的表达,流式细胞仪检测细胞的凋亡和增殖。结果诱导放疗可显著增强双自杀基因CDglyTK对Tca8113细胞的毒性作用;RT-PCR半定量分析诱导放疗增强了CDglyTK基因的mRNA表达;流式细胞检测发现治疗组细胞的凋亡指数明显高于对照组,而增殖指数则低于对照组,诱导放疗显著提升了这种差距。结论人工合成放射诱导启动子可作为基因治疗中的分子开关调节CDglyTK基因在Tca8113细胞中靶向表达。低剂量放射性照射可显著提高放射诱导启动子调控的CDglyTK基因治疗Tca8113细胞的疗效。

光诱导和组成型启动子控制柠檬酸合酶基因过量表达对转基因烟草耐铝性影响的比较

分别用光诱导型启动子（PrbcS）和组成型启动子（Ca MV35S）驱动柠檬酸合酶基因（cs）在转基因烟草中过量表达,比较转基因烟草中柠檬酸的含量和分泌量及其铝耐受性的变化.结果表明：诱导型转基因株系的CS酶活性是野生型的2.3~2.4倍,组成型转基因株系的酶活性是野生型的1.6~2倍;在30μmol·L-1铝胁迫下,诱导型转基因植株的根相对伸长量是野生型的2.8~2.9倍,组成型的根相对伸长量是野生型的2~2.3倍;在无铝或300μmol·L-1铝胁迫下,转基因烟草叶片和根中柠檬酸含量均高于野生型,其中诱导型转基因植株叶片中柠檬酸含量高于组成型转基因植株,转基因烟草柠檬酸的分泌量分别是野生型的1.8~2.0倍和3.0~3.3倍;在有铝胁迫的珍珠岩基质上培养时,转基因烟草的生长情况好于野生型.这些结果证明,与Ca MV35S相比,采用PrbcS启动子控制cs基因的过量表达可更有效地增加转基因烟草中CS的酶活性及叶片中柠檬酸的合成量,同时也能更有效地提高转基因烟草柠檬酸的分泌量,从而增强其对铝毒害的抵御能力.

含双病原物诱导启动子植物安全表达载体的构建

本研究用来自烟草的具有高度病原物特异性的两个诱导启动子EAS4和hsr203J,串联驱动GUS基因的表达,同时考虑到转基因植物的安全性,引入双边界序列,构建了含双病原物诱导启动子的植物安全表达载体。将表达载体转化烟草获得转基因植株。分析显示,在正常生长情况下转基因烟草检测不到GUS活性,或活性极低;而受疫霉激发子parasiticein、Phytophthora nicotianea[0]的孢子悬浮液和Ralstonia solanacarum的菌悬液诱导后,转基因烟草叶片中可检测到明显的GUS活性。结果表明,构建的植物表达载体所含双病原物诱导启动子均具有良好的诱导活性,可用于植物遗传转化。

串联双病原物诱导启动子驱动基因表达的特性

在植物抗病基因工程中,目标基因可控的高效表达是一重要目标。在前期的研究中,我们将串联的病原物高度特异性诱导启动子EAS4(EP)和hsr203J(HP)转入烟草,uidA基因在相应病原物或激发子诱导后可被驱动表达。为进一步研究此串联双启动子驱动的基因表达特性,采用荧光法对GUS诱导表达活性进行了定量检测。结果发现,双启动子表现较高的诱导表达活性,双启动子与单启动子的活性差异均达极显著水平。研究还发现,两个启动子串联的顺序对其活性强度和时间动态有影响,双启动子HP+EP的诱导表达高峰出现在诱导后6～10 h,而EP+HP的活性高峰出现在诱导后8～14 h。同时,初步分析了串联的EP和HP协同促进基因高水平表达的原因。串联的双病原物特异性诱导启动子不但可响应较广谱的病原物的诱导表达,而且可协同促进基因的高效表达,因而在植物抗病基因工程中具有广阔的应用前景。

放射诱导启动子介导p53上调凋亡调控因子基因靶向治疗舌鳞状细胞癌裸鼠移植瘤

目的探讨放射诱导启动子介导p53上调凋亡调控因子(PUMA)基因靶向治疗舌鳞状细胞癌(简称舌鳞癌)裸鼠移植瘤的疗效。方法构建放射诱导启动子介导PUMA基因表达的真核表达质粒pcDNA(+)3.1/E-PUMA,建立人舌鳞癌裸鼠移植瘤模型,以脂质体为载体进行瘤内转染,辅以3Gy放疗,描述肿瘤生长曲线,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测PUMA的mRNA水平,免疫组化检测细胞核增殖抗原的表达,原位末端标记法检测细胞凋亡。数据分析采用SPSS 11.0统计软件,两样本均数比较采用χ2检验。结果放射诱导启动子介导的PUMA基因转染对舌鳞癌裸鼠移植瘤生长有明显抑制作用,诱导放疗显著增强了PUMA的mRNA表达水平,RT-PCR检测发现其电泳条带灰度值从(0.325±0.075)上调至(0.371±0.096),P<0.01;诱导放疗可显著提高疗效,增殖指数由32.27%下降至22.77%,P<0.01;凋亡指数从14.43%上升为27.98%,P<0.01。结论放射诱导启动子作为基因治疗分子开关可介导PUMA基因在人舌鳞癌裸鼠移植瘤中靶向表达促进细胞凋亡,为舌鳞癌放射基因治疗提供了新思路。

纳米载体介导热诱导启动子调控内皮抑素基因治疗肝细胞癌

目的探讨加热诱导调控下纳米载体介导内皮抑素（Endo）基因治疗对肝癌细胞HepG2的体内外杀伤作用。方法双酶切法构建热诱导启动子（HSP70B）调控Endo基因的重组质粒pcDNA3．1（＋）／HSP70-Endo／EGFP。溶剂挥发法制备载DNA的葡聚糖接枝聚乳酸纳米粒，透射电镜观察载DNA纳米粒的形态，并介导转染HepG2细胞，转染24h后予以37℃、39℃、41℃、43℃、45℃加热诱导30min，荧光显微镜和流式细胞术检测不同温度下EGFP表达，ELISA检测转染细胞上清Endo蛋白浓度，MTT法检测热诱导后Endo对HepG2和ECV304细胞生长的影响，动物实验观察热诱导后Endo对肝癌移植瘤的抑制作用。结果载DNA纳米粒呈圆形或椭圆形，粒径约90～120nm，转染效率约30．65％。低温加热可增强HepG2细胞中Endo／EGFP表达，43℃组EGFP表达强度达37℃组的3．3倍。43℃热诱导后转染细胞上清中Endo浓度为（177±28）μg／L，高于不加热组（41±10）μg／L。Endo抑制ECV304的生长，72h时热诱导后细胞抑制率为96．3％，对HepG2细胞的生长却无影响。体内实验显示热诱导后Endo显著抑制肝癌移植瘤的生长，肿瘤抑制率为58．5％，高于不加热组（34．9％）。结论纳米载体可介导Endo基因转染HepG2细胞，低温加热可增强HepG2细胞内Endo基因的表达和分泌，抑制肝癌移植瘤的生长。

植物受病原物诱导启动子概述

植物受病原物诱导启动子是一类能对病原物的侵染作出响应的启动子,其活性主要局限于被侵染之时及被侵染的位点。植物受病原物诱导启动子的这一特性赋予其在抗病基因工程中潜在的应用价值。相比植物庞大的启动子组,已发现的植物受病原物诱导启动子仍是少数,关于其作用机制的研究仍有待加强和深入,而其调控的基因与植物抗病性关系还需要引起足够的重视。作者在对植物受病原物诱导启动子进行归类的基础上,重点关注了病原物诱导启动子调控基因的编码产物与植物抗病性的关系,对植物受病原物诱导启动子的顺式调控元件作了简要分析,并对该领域的发展动向进行了讨论。

含双病原物诱导启动子无选择标记转基因烟草的获得

外源基因的引入造成转基因植物的食用安全性和环境安全性问题。此外，选择标记基因还可能使植株再生困难，及后继转基因工作不能再用相同的选择标记基因。若转基因植株在释放时其外源抗性选择标记基因得到剔除，则上述问题可得到解决。

放射诱导启动子介导双自杀基因治疗舌鳞癌的实验研究

目的探讨放射诱导启动子介导双融合自杀基因CDglyTK靶向治疗人舌鳞癌裸鼠移植瘤的疗效。方法构建人舌鳞癌裸鼠移植瘤模型,以脂质体为载体介导携放射诱导启动子调控双融合自杀基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/E-CDglyTK瘤内转染,辅以3Gy放疗,腹腔注射5-氟胞嘧啶和丙氧鸟苷,描绘肿瘤生长曲线,RT-PCR检测CDglyTK的mRNA水平,免疫组化检测细胞核增殖抗原的表达,原位末端标记法检测肿瘤细胞凋亡。结果放射诱导启动子介导的CDglyTK对肿瘤生长有明显抑制作用,RT-PCR可检测到转染后肿瘤细胞CDglyTK的mRNA表达,诱导放疗增强了其表达水平,电泳条带灰度值从0.213±0.023上调至0.279±0.038(P<0.01);诱导放疗显著提高疗效,凋亡指数从21.52%上升为32.23%(P<0.01),增殖指数由28.36%下降至20.07%(P<0.01)。结论放射诱导启动子可作为基因治疗分子开关调节CDglyTK基因在人舌鳞癌裸鼠移植瘤中靶向表达,低剂量放射性照射可显著提高其疗效。

水稻PBZ1基因启动子对烯丙异噻唑的诱导响应性分析

[目的]依据水稻PBZ1基因对一种环境友好型化学诱导剂烯丙异噻唑(3-allyloxy-1,2-benzisothiazole-1,1-dioxide,PBZ)的高响应性,旨在分析该基因启动子作为一种新型化学诱导启动子的应用潜力。[方法]首先构建PBZ1启动子与GUS的融合报告载体PPBZ1-1942bp::GUS,分别采用烟草叶片瞬时表达及转基因水稻稳定表达系统,检测PBZ1启动子对PBZ的诱导响应性;并且利用水稻原生质体瞬时表达系统,进一步分析不同长度的PBZ1启动子片段的诱导响应性。[结果]无论是在瞬时还是稳定表达系统中检测,PBZ1启动子均可以有效响应PBZ的诱导。本研究还首次证明水稻PBZ1基因响应PBZ诱导很大程度上依赖于茉莉酸(JA)信号途径。因此,在水稻原生质体瞬时表达系统中,我们采用茉莉酸甲酯(Me JA)作为诱导剂,替代不适用于水稻原生质体体系的PBZ,有效地验证了1 053和608 bp长度的启动子片段具有更好的诱导响应性。[结论]水稻PBZ1启动子具备作为一种基于PBZ诱导系统的新型化学诱导启动子的潜力。

干旱诱导性启动子驱动的海藻糖-6-磷酸合酶基因载体的构建及转基因烟草的耐旱性

通过PCR程序克隆拟南芥 (Arabidopsisthaliana (L .)Heynh .)的干旱诱导性启动子Prd2 9A及来自酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeHansen)的海藻糖_6_磷酸合酶基因 (TPS) ,并将它们组成可在植物中表达的载体RT。通过根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens (SmithetTownsend)Conn)LBA44 0 4介导 ,获得转基因烟草 (NicotianatabacumL .)。Southern分析表明TPS基因已经整合到烟草基因组中。Northern分析表明TPS基因的表达受干旱胁迫的诱导。转基因烟草的形态发生多种改变 ,包括变矮 ,茎变细 ,叶子呈柳叶状 ,腋芽明显 ,同时耐旱性得到增强。

转逆境诱导型启动子SWPA2驱动Cu/ZnSOD和APX基因甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)耐盐性

本研究以盐胁迫下逆境诱导型启动子SWPA2驱动转Cu/Zn SOD和APX基因甘薯叶片一些生理指标的变化研究转基因甘薯耐盐性。结果表明:无胁迫时,转基因甘薯叶的生理指标与未转基因植株无明显差异。相同胁迫条件下,转基因甘薯叶的超氧化物歧化酶(SOD),抗坏血酸过氧化物酶(APX),过氧化物酶(POD),过氧化氢酶(CAT)活性均高于未转基因甘薯叶,尤以100mmol/LNaCl胁迫下差异最显著;转基因植株的根长也大于未转基因植株;转基因植株的叶绿素下降幅度和MDA含量则低于未转基因植株。这说明转基因甘薯具有一定的耐盐性。因此开发种植转基因耐盐甘薯对有效利用盐渍化土地和缓解能源危机有重大的意义。

水稻稻瘟病菌诱导表达启动子OsQ16p的克隆与功能分析

qRT-PCR分析表明,日本晴OsQ16基因受稻瘟病菌诱导表达。利用PCR技术从日本晴基因组中克隆了该基因编码区5′端上游1229bp的启动子序列,命名为OsQ16p。用其取代pBI121中gus基因上游的CaMV35S启动子,构建重组表达载体pBIQ16p,经农杆菌介导转化日本晴,获得转基因植株。GUS组织化学染色和qRT-PCR分析表明:gus基因在抗性愈伤组织和阳性转基因植株中均能表达;转基因植株在接种稻瘟病菌后12h,GUS表达量是处理前的2.7倍;抗病相关信号分子水杨酸(salicylic acid,SA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)喷施转基因植株叶面后12h,GUS表达量分别为处理前的3.1倍和3.5倍。以上结果表明,OsQ16p启动子具有启动活性,并明显受稻瘟病菌、MeJA和SA诱导表达。

转录因子CBF4诱导型启动子的克隆及功能分析

根据已有文献及公开的拟南芥基因组序列,利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsisthaliana)基因组DNA中扩增得到了转录因子CBF4上游的DNA片断,对其进行序列分析表明与GenBank序列高度同源,同时对其进行初步的功能分析。采用生物信息学方法对这一序列分析的结果显示这一片段具有启动子的特殊结构域;与GUS基因融合构建双元表达载体,转化烟草的组织特异性表达检测可见明显的GUS活性,初步表明所获片断为CBF4基因的诱导型启动子。

受细菌诱导的植物启动子的克隆及其在转基因烟草中的活性

从烟草中克隆了受病原物诱导的植物启动子 (pathogen inducibleplantpromoters,PPPs)PPP1、PPP2、PPP3,其长度分别为 130 8,1170 ,2 2 0bp ,序列分析表明它们均含有受细菌诱导的反应元件 (Bac)。资料检索表明 ,PPP3可能是从植物分离的、受细菌诱导的最短的启动子。构建了包括每个PPP启动子和报道基因uidA (编码 β 葡萄糖醛酸酶 ,GUS)的转化单元 ,用它们以及包括来自椰菜花叶病毒 35S启动子和uidA单元 ,在相同条件下分别转化烟草 ,获得了分别含PPP和 35S启动子的 4类转基因烟草品系 ;分子检测表明 ,转化单元在转基因烟草染色体上能稳定整合。根据对转基因烟草GUS组织化学测定 。

逆境诱导型启动子rd29A的克隆及植物表达载体的构建

根据文献上发表的逆境诱导型启动子rd2 9A序列设计并合成了一对引物 ,通过PCR的方法从拟南芥基因组中扩增到rd2 9A的启动子序列。根据GenBank中已发表的转录因子DREB1A基因的cDNA序列设计并合成了一对引物 ,通过RT PCR的方法从低温处理的拟南芥总RNA中扩增出DREB1A基因的全长cDNA片段。以植物表达载体pBch为基础 ,构建了由rd2 9A调控的DREB1A基因的植物表达载体pBDR2 9A 。

水稻干旱诱导型启动子Oshox24P的分离与鉴定

为了挖掘水稻中的逆境诱导型启动子,挑选了1个受干旱胁迫强烈诱导的水稻内源基因Oshox24,分离出该基因的启动子(命名为Oshox24P),通过酶切连接的方法构建GUS报告基因表达载体并转化到受体材料中花11中,通过对转基因后代在不同逆境胁迫下的GUS活性检测,证明该启动子强烈地受到干旱胁迫的诱导,上调表达倍数至十几倍,同时该启动子还受到脱落酸(ABA)的诱导,对高盐和低温胁迫的反应并不明显。结果表明,该启动子属于干旱诱导型启动子,可以用于控制目标基因在水稻中的表达。