诱导型神经干细胞移植抑制颅脑创伤后补体活化的影响

目的研究诱导型神经干细胞(iNSCs)移植对颅脑创伤(TBI)后补体活化的影响。方法采用自由落体脑打击装置制备雄性成年C57BL/6小鼠TBI模型,将30只神经功能缺损评分(NSS)为4～8分的小鼠纳入TBI组,按照随机数字表法选取10只用于制备TBI小鼠血清和热灭活TBI小鼠血清,余下20只按照按照随机数字表法分为:iNSCs移植组(10只)和磷酸缓冲盐溶液(PBS)处理组(10只)。同时设置假手术(sham)组(10只)。于TBI后12 h,分别将含5×106个iNSCs单细胞悬液或等体积PBS经尾静脉注射到TBI小鼠体内,于移植后7 d处死动物,取脑组织行双重免疫荧光染色,观察iNSCs移植对TBI小鼠脑内C3d和NeuN抗体双阳性、C5b-9和NeuN抗体双阳性、C3d和Map2抗体双阳性以及C5b-9和Map2抗体双阳性的神经细胞的影响。于TBI后12 h,制备TBI小鼠血清和热灭活TBI小鼠血清,分别处理iNSCs后用流式细胞仪检测iNSCs表达补体调节分子Crry、Cd46、Cd59a和Cd55水平。结果双重免疫荧光染色示:相比sham组,TBI小鼠脑组织中明显可见C3d和C5b-9沉积于NeuN和Map2抗体阳性的神经细胞;相比PBS处理组,iNSCs移植组TBI小鼠脑内C3d和NeuN抗体双阳性、C5b-9和NeuN抗体双阳性、C3d和Map2抗体双阳性以及C5b-9和Map2抗体双阳性的神经细胞数量均明显下降,2组差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测示:相比热灭活TBI小鼠血清组,TBI小鼠血清组中iNSCs补体调节分子Crry表达水平明显上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论经静脉移植iNSCs可抑制TBI后补体活化,减轻神经损伤。

诱导型神经干细胞对颅脑创伤后免疫细胞的影响

目的研究诱导型神经干细胞(i NSCs)移植对颅脑创伤(TBI)后小胶质细胞活化状态和反应性星形胶质细胞增生的影响。方法采用自由落体脑打击装置制备C57BL/6小鼠TBI模型,将1×10~6个iNSCs移植到TBI小鼠脑内,于移植后7 d处死动物,取材进行形态学研究。用双重免疫荧光染色,分别观察i NSCs移植对TBI小鼠脑内ED1和Iba1抗体双阳性的小胶质细胞、GFAP抗体阳性星形胶质细胞以及Neu N抗体阳性神经元的影响。结果 TBI后小鼠脑内可见大量ED1和Iba1抗体双阳性的小胶质细胞和GFAP抗体阳性的星形胶质细胞,而i NSCs移植物明显减少了ED1和Iba1抗体双阳性的小胶质细胞和GFAP抗体阳性的星形胶质细胞的数量,并且明显减轻了Neu N抗体阳性的神经元的凋亡。结论 i NSCs移植物在TBI小鼠脑内,可调控小胶质细胞活化状态,抑制反应性星形胶质细胞增生,有利于神经元存活。

诱导型神经干细胞移植对颅脑创伤后神经营养因子分泌的影响

目的研究诱导型神经干细胞(iNSCs)移植对颅脑创伤(TBI)后神经营养因子分泌的影响。方法采用自由落体脑打击装置制备雄性成年C57BL/6小鼠TBI模型,将神经功能缺损评分(NSS)4~8分者纳入TBI组,按照随机数字表法分为iNSCs移植组(12只)和磷酸盐缓冲液(PBS)处理组(9只)。同时设置假手术(sham)组(9只)。于TBI后12 h,用脑立体定向仪将含1×106个iNSCs单细胞悬液或等体积PBS分别移植到TBI小鼠脑内,于移植后7 d处死动物。分别取脑组织mRNA(3只/组)行逆转录定量实时聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白(6只/组)行酶联免疫吸附测定(ELISA),检测脑源性神经营养因子(BDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达量;取iNSCs移植组(3只)动物脑组织行免疫荧光染色,观察iNSCs移植物分泌BDNF和GDNF。结果RT-qPCR示:相比sham组,TBI小鼠脑组织中Bdnf和Gdnf基因转录水平明显降低;相比PBS处理组,iNSCs移植组TBI小鼠脑组织中Bdnf和Gdnf基因转录水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。ELISA示:相比sham组,TBI小鼠脑组织中BDNF和GDNF蛋白表达水平明显降低;相比PBS处理组,iNSCs移植组TBI小鼠脑组织中BDNF和GDNF蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光染色示iNSCs移植组TBI小鼠脑内可见绿色荧光蛋白标记的iNSCs移植物迁移到达脑损伤区并表达BDNF和GDNF。结论经脑立体定向移植iNSCs可在TBI后脑组织中合成分泌神经营养因子BDNF和GDNF,发挥神经营养作用。

颅脑创伤动物血清预处理诱导型神经干细胞移植对补体活化的影响

目的研究颅脑创伤(TBI)动物血清预处理诱导型神经干细胞(iNSCs)立体定向移植对TBI后补体活化的影响。方法采用自由落体脑打击装置制备雄性成年C57BL/6小鼠TBI模型,将48只神经功能缺损评分(NSS)为4~8分的小鼠纳入TBI组,按照随机数字表法选取24只用于制备TBI小鼠血清和热灭活TBI小鼠血清,余下24只按照随机数字表法分为TBI小鼠血清预处理iNSCs(TBI-iNSCs)移植组(6只)、热灭活TBI小鼠血清预处理iNSCs(HITBI-iNSCs)移植组(6只)、磷酸盐缓冲液(PBS)预处理iNSCs(PBS-iNSCs)移植组(6只)和对照(Control)组(6只)。同时设置假手术(Sham)组(6只)。于TBI后12h,用脑立体定向仪分别将含1×106个TBI-iNSCs、HITBI-iNSCs、PBS-iNSCs单细胞悬液或等体积PBS移植到TBI小鼠脑内。于TBI后14d处死动物,取脑组织行Westernblot检测补体活化产物(C3d和C9)、补体调节因子Crry和细胞凋亡标记物activeCaspase-3等蛋白表达水平;取脑组织行免疫荧光染色和原位末端标记(TUNEL)染色,观察TBI-iNSCs、HITBI-iNSCs和PBS-iNSCs移植对TBI小鼠脑内NeuN抗体阳性和TUNEL阳性细胞数量的影响。结果Westernblot检测示:相比Sham组,PBS-iNSCs组、HITBI-iNSCs组、TBI-iNSCs组和Control组C3d、C9和activeCaspase-3表达水平明显增高;而相比Control组,PBS-iNSCs组、HITBI-iNSCs组和TBI-iNSCs组C3d、C9和activeCaspase-3表达水平明显降低;相比PBS-iNSCs组和HITBI-iNSCs组,TBI-iNSCs组C3d、C9和activeCaspase-3表达水平明显降低,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。此外,相比Control组,PBS-iNSCs组、HITBI-iNSCs组、TBI-iNSCs组和Sham组Crry表达水平明显增高;相比Sham组,PBS-iNSCs组、HITBI-iNSCs组和TBI-iNSCs组Crry表达水平明显增高;相比PBS-iNSCs组和HITBI-iNSCs组,TBI-iNSCs组Crry表达水平明显增高,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光染色和TUNEL染色示:PBS-iNSCs组和HITBI-iNSCs组NeuN抗体阳性和TUNEL阳性的细胞数量差异无统计学意义;然而,与PBS-iNSCs组和HITBI-iNSCs组相比,TBI-iNSCs组NeuN抗体阳性和TUNEL阳性的细胞数量明显减少,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论TBI小鼠血清预处理iNSCs立体定向移植可上调TBI小鼠脑内Crry水平,抑制补体活化,减轻脑损伤。

不同方法诱导小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为神经干细胞效率的比较

目的比较不同方法诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)直接转化为诱导型神经干细胞(induced neural stem cells, iNSCs)的效率,以进一步优化诱导方法。方法构建慢病毒表达载体pLenti6.3-Sox2-IRES2-EGFP,分别采用单转录因子Sox2、小分子物质、转录因子Sox2联合小分子物质共同作用三种方法将MEFs直接转化为iNSCs。qPCR检测神经干细胞的标志基因和多潜能标志基因的表达。免疫荧光检测神经干细胞的标记物nestin,计算iNSCs的转染效率。iNSCs在分化培养基中贴壁培养7~14 d,免疫荧光分别检测神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞标记物MAP2、GFAP和Olig2的表达。结果诱导后4~6 d,MEFs的形态发生明显改变。免疫荧光显微镜下的结果显示诱导因子Sox2加小分子的诱导方法较单独使用Sox2和单独使用小分子物质进行诱导的效率高,差异具有统计学意义( P <0.05)。qPCR的结果证明,3组iNSCs多种神经干细胞的标志基因(Sox2、nestin、Blbp、Pax6)的表达均较MEFs明显增高,3组间差异无统计学意义( P >0.05);共聚焦显微镜的结果证明3种方法诱导的iNSCs具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力,3组间差异无统计学意义( P >0.05)。结论转录因子Sox2联合小分子共同作用可显著提高MEFs转化为iNSCs的效率且并不改变iNSCs的细胞功能特点。3组的iNSCs均具有神经干细胞自我增殖和多向分化的能力。

体细胞直接重编程为神经元和神经干细胞

体细胞直接重编程是由已分化细胞类型不经过诱导型多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,i PSCs)中间阶段,直接转换为另一种细胞类型的重编程过程。体细胞直接重编程避免了i PSC技术存在的重编程效率低下、引入致癌基因等多种缺陷,并为细胞替换治疗和个性化医药研发设想贡献了新的实现途径。现代医学对于诸如神经退行性疾病、神经遗传疾病和外伤导致的神经细胞受损等一些神经系统疾病一直没有有效的治疗手段。而体细胞直接重编程为治疗这些疾病提供了另一种治疗途径,因此体细胞直接重编程为神经细胞相关领域迅速成为研究热点。回顾了体细胞重编程为诱导型神经元(Induced neurons,i Ns)和诱导型神经干细胞(Induced neural stem cells,i NSCs)的最新研究进展,并探讨i Ns和i NSCs在临床应用上的各自优势、局限性及应用前景。