体外培养时间对诱导多能干细胞源性心肌细胞成熟度的影响

背景:研究已证实诱导多能干细胞能够定向分化为心肌细胞,但目前很少有分化心肌细胞成熟度的研究报道。目的:探讨延长诱导分化时间对诱导多能干细胞源性心肌细胞的形态、肌节长度、双核细胞含量、心脏基因表达、心脏蛋白表达和线粒体功能的影响。方法:使用骨形态发生蛋白4、CHIR 99021和IWR1诱导多能干细胞向心肌细胞分化,分别在第20天和第40天收集分化心肌细胞;采用RT-PCR和免疫荧光检测分化心肌细胞中心脏基因和蛋白的表达水平;LAS X图像分析软件分析分化心肌细胞形态和肌节长度;MitoTracker Green FM线粒体染色检测线粒体总量,JC-1线粒体染色检测线粒体膜电位。结果与结论:与第20天的分化心肌细胞相比,第40天的分化心肌细胞的细胞周长和肌节长度更长、细胞面积更大(P<0.05);多核细胞比例从第20天的16%左右大幅上升至第40天的29%左右(P<0.05);第40天的分化心肌细胞具有与原代心肌细胞更相近的基因表达水平,SERCA2A、Cx-43和α-MHC基因表达水平明显高于第20天的分化心肌细胞(P<0.05);与第20天的分化心肌细胞相比,第40天的分化心肌细胞中TNNT2和α-MHC蛋白表达水平较高,线粒体分布密度更大,且功能性线粒体数量增加(P<0.05)。结果表明:延长诱导分化时间,可以通过增加肌节长度和功能性线粒体数量以及升高心脏基因和蛋白表达水平而提高分化心肌细胞的成熟度。

诱导性多能干细胞(iPSCs)在牙再生中的应用

干细胞能够自我更新并分化成各类组织细胞,在再生医学中具有很大的应用潜力。随着组织工程的快速发展,以胚胎干细胞和组织干细胞为基础的牙再生技术有待成为替代缺失牙的一种重要方法,然而免疫排斥和伦理的争议等问题为干细胞的临床应用带来很大的困难。由自体细胞产生的诱导性多能干细胞的发现将为牙齿再生带来革命性变化。本文就诱导性多能干细胞的研究背景及其在再生医学和牙再生领域的应用进展作一综述。

诱导多能干细胞-iPSCs在胆管病研究中的应用

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)是在形态、基因表达、细胞自我更新、以及分化潜能等方面与胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)相似的一类细胞,但却避免了ESCs应用中的免疫排斥和伦理道德等问题.i PSCs在多种疾病研究上取得的成就为肝脏疾病提供了良好的借鉴.以原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎等为代表的一组胆管病虽非常见疾病,但发病机制不清、有效治疗手段匮乏、预后差.因此发展胆管病患者源性的、个体化的i PSCs及其诱导分化的功能细胞可在体外模拟疾病的表型及病理过程,应用此细胞模型对研究发病机制、药物筛选和疗效评估等具有重要意义.

哺乳动物多能干细胞:在创建疾病模型、发病机制、药物发现和个性化治疗中的作用

背景:多能干细胞的自我更新和多向分化的特征有可能彻底改变人们对生物学、医学、发育和疾病的理解。干细胞在胚胎发育的早期发挥着重要作用,研究干细胞可以深入理解生物体发育和组织器官形成的基本原理,探索各种疾病的潜在机制,研究受损组织和器官的修复和再生,以及推动药物发现和个性化治疗。目的:回顾多能干细胞的研究历程,并对多能干细胞的基本类别进行归纳总结,同时阐述常见哺乳动物中各类多能干细胞的建系情况。方法:应用计算机检索PubMed、Web of Science、中国知网和万方数据库,检索词为“多能干细胞,胚胎干细胞,诱导多能干细胞,扩展多能干细胞,家畜多能干细胞,Pluripotent stem cells,Embryonic stem cells,Induced pluripotent stem cells,Expanded potential stem cells,Livestock pluripotent stem cells等”,根据纳入标准和排除标准系统地筛选与哺乳动物多能干细胞相关的文献99篇进行综述分析。结果与结论:(1)小鼠胚胎干细胞经典理论认为,干细胞的多能态分为“初始”(na?ve)态和“始发”(primed)态两种,na?ve态对应于早期胚胎未植入子宫壁前的囊胚内细胞团;primed态对应于植入后的上胚层,二者在表观遗传特征、转录活性、外部信号依赖性和代谢表型等方面存在显著的特征差异;后来研究发现在初始态和始发态之间,还存在一个过渡状态——“形成态”(formative态);事实上,胚胎干细胞的多能性属于连续阶段的发展进程,而不是某种独立的细胞状态。(2)除了从囊胚内细胞团获得多能干细胞之外,还有多种多能干细胞获得方式和建系方法:如利用来源于小鼠胎儿原始生殖细胞所建立的胚胎生殖干细胞;利用Oct3/4,Sox2,c-Myc和Klf4因子诱导成年小鼠和人的成纤维细胞去分化所建立的诱导多能干细胞;体细胞核移植,孤雌激活,以及从新生或成体睾丸组织或卵巢组织中分离并进行类胚胎干细胞培养所建立的胚胎干细胞样细胞系;来源于多种成体组织的极小胚胎样干细胞和来源于前囊胚期的扩展多能干细胞,这些多能干细胞的共同特征为不断自我更新,表达核心多能因子,并具备原始三胚层分化能力。(3)目前,多能干细胞正在被用于疾病建模,以便研究不同疾病的机制并开发新的药物。同时,科学家正在尝试用多能干细胞培养各种组织和器官,为再生医学和移植提供新的可能性。然而,多能干细胞的临床应用面临着安全性挑战,包括细胞畸变和免疫排斥问题。不断改进多能干细胞的产生方法,将使其更安全、高效地适用于临床。(4)借鉴小鼠和人多能干细胞的获得方式和建系方法,研究者们已经在家畜中建立了各类多能干细胞,包括胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、生殖细胞谱系的多能干细胞和扩展多能干细胞,这将为动物繁殖育种、基因工程、疾病模型、新药筛选和野生濒危动物保护提供新的途径。

面肩肱肌营养不良症患者外周血单个核细胞来源的诱导多能干细胞的构建及骨骼肌分化

目的建立并鉴定面肩肱肌营养不良症(FSHD)患者外周血单个核细胞(PBMC)来源的诱导多能干细胞(iPSCs),初步探讨其骨骼肌分化能力,评估该细胞模型应用于疾病机制研究的可行性。方法收集1例FSHD患者的PBMC,用含4个重编程转录因子(OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC)的仙台病毒感染PBMC并获得FSHD患者来源的iPSCs,继续诱导其骨骼肌分化。通过基因组光学图谱技术、核型、免疫荧光染色、实时荧光定量PCR等分析iPSCs和骨骼肌细胞特性。结果成功获得FSHD患者来源的iPSCs,其可表达多能干性标记。FSHD-iPSC核型及D4Z4拷贝数结果与患者的临床背景一致,并在体外可定向诱导分化为骨骼肌细胞,该细胞同时表达DUX4致病基因以及调节基因。结论FSHD患者来源的PBMC可重编程为iPSCs,FSHD-iPSC可分化为疾病相关的肌源组细胞及肌管细胞,为FSHD发病机制的体外研究提供了良好的细胞模型,并为寻找该病的有效治疗手段提供了工具。

人诱导多能干细胞用于心血管疾病治疗的研究进展

现阶段中国心血管疾病高发,传统治疗方式包括药物缓解和介入手术治疗,仅减缓疾病进展而无法逆转已存在的组织损伤,其治疗周期长、患者医从性低。故急需对此类疾病进行更深入的研究,以提出更有效的治疗方案,因此人诱导多能干细胞作为新的突破口为疾病治疗提供了思路。人诱导多能干细胞不仅可直接替代和间接修复受损的细胞,补偿心脏收缩功能;还能通过构建特定的疾病模型来作为个体基因组学、蛋白组学的研究平台,从而深入剖析疾病的机制与进程,实现疾病个体化预测、预防和治疗,达到提高患者心脏泵血功能、延长生存期限的最终目的。现对人诱导多能干细胞用于心血管疾病治疗做一综述。

诱导多能干细胞瘤变的研究进展

诱导多能干细胞(IPSC)是体细胞重编程后得到的与胚胎干细胞相似的具有自我更新和多向分化潜能的细胞,这一发现成功避开了胚胎干细胞的伦理问题。自IPSC问世,这项技术就迅速应用于疾病建模、药物开发、再生医学和基因调控,尤其是再生医学自体移植研究领域。但是,IPSC移植后瘤变成为IPSC用于再生医学的一大阻碍,因此IPSC的瘤变成为当前IPSC研究的热点问题。本文就IPSC与肿瘤细胞的关系、IPSC移植后成瘤机制、降低IPSC移植后瘤变率以及IPSC移植后体内监测技术等几个方面进行简要综述。

诱导性多能干细胞(iPS)的应用和研究进展

体外诱导人类体细胞转变为多能干细胞与传统的胚胎干细胞研究相比,相对简单,摆脱了材料来源和伦理学的诸多限制,因而引起了生命科学领域一次巨大的革命,尤其在医学上进步显著,被用于治疗遗传病、研究发病机制、利用患者自身细胞治疗疾病等方面。虽然目前对诱导性多能干细胞的应用和进展成果显著,但仍存在一系列亟待解决的问题,包括转变机理、安全性和效率低下等问题。本文重点阐述此项技术在医学上的应用和进展,以及仍然存在的问题和突破。

毛蕊异黄酮对人诱导多能干细胞内皮分化的影响及机制

背景:内皮损伤是心血管疾病的诱因之一,人诱导多能干细胞易于获得、分化能力强、排异性较小,其内皮分化细胞可被用作心血管疾病研究的理想细胞。目的:探讨毛蕊异黄酮对人诱导多能干细胞定向内皮分化的作用及机制,为微血管再生提供技术支持。方法:将人诱导多能干细胞分为对照组与毛蕊异黄酮1.25,2.5μg/mL组,进行内皮定向诱导分化。诱导分化8 d后,采用流式细胞术检测各组细胞内皮细胞标志物CD144阳性率,免疫荧光技术检测CD144、CD31荧光表达。利用慢病毒RNAi-GFP puromycin沉默人诱导多能干细胞Piezo1 mRNA,再进行内皮定向诱导分化,诱导分化8 d后,采用流式细胞术检测分化细胞CD144阳性率,qPCR检测CD144、Piezo1、MEK的mRNA表达水平。结果与结论:①与对照组相比,毛蕊异黄酮1.25,2.5μg/mL组CD144阳性率显著升高(P<0.05);毛蕊异黄酮2.5μg/mL组CD144、Piezo1、MEK mRNA表达水平提高(P<0.05);毛蕊异黄酮2.5μg/mL组CD144(P<0.01)和CD31(P<0.001)荧光表达显著升高;②与shNT组相比,shNT+毛蕊异黄酮1.25,2.5μg/mL组CD144阳性率和CD144、Piezo1、MEK mRNA表达显著升高(P<0.05),与shPiezo1组相比,shPiezo1+毛蕊异黄酮1.25,2.5μg/mL组CD144阳性率和CD144、Piezo1、MEK mRNA表达无显著变化(P>0.05);③实验结果提示2.5μg/mL毛蕊异黄酮能够促进人诱导多能干细胞内皮分化,毛蕊异黄酮可以通过靶向调节Piezo1表达水平,促进下游MEK表达,从而促进人诱导多能干细胞内皮分化。

诱导多能干细胞在遗传性心脏疾病模型中的应用与机制

背景:遗传性心脏病具有较高的患病率及死亡率,至今其发病机制仍未阐明。尽管部分遗传性心脏病已经建立了相应的动物模型,为研究遗传性心脏病的发病机制提供了一定的基础,但是由于物种间的差异等原因显著降低了这些研究结果的价值,因此,需要全新的模型来探索其发生发展过程。目的:综述了目前诱导多能干细胞在构建多种遗传性心脏病模型中的作用和潜在的应用前景。方法:第一作者于2023年1-3月期间应用计算机在Pub Med数据库中检索近13年的相关文献,以“induced pluripotent stem cell,inherited heart disease,congenital heart disease”等为检索词,最终纳入76篇文献进行分析。结果与结论:自2007年诱导多能干细胞从人体体细胞中诱导建立以来,已有许多针对疾病特异性诱导多能干细胞的研究报道。由于疾病特异性诱导多能干细胞能够再现疾病表型,因此有望成为体外疾病建模的一种新研究工具,用于分析发病机制和研制辅助药物。在心血管遗传性疾病的研究方面,从患者特异性诱导多能干细胞分化得到的心肌细胞中含有参与心脏发育异常相关的基因突变,因此,其可作为一种全新的工具研究遗传性心脏病的潜在机制。到目前为止,诱导多能干细胞来源心肌细胞已被广泛用于多种遗传性心脏疾病的分子机制研究,如心脏电生理性疾病、心肌病以及一些综合征性遗传性心脏疾病。

诱导多能干细胞中几种关键基因的研究及iPS潜在医学价值

体细胞重编程为诱导多能干细胞中涉及到几种基因,这几种基因在维持细胞全能性及自我更新中的具有重要作用。本文论述这几种基因的功能。论述iPS在医学领域中潜在价值。

诱导多能干细胞来源的间充质干细胞的治疗潜力与应用风险

诱导多能干细胞衍生的间充质干细胞(iMSC)已被提出作为原代间充质干细胞(MSC)的替代来源,在疾病治疗相关研究中也显示出多种优势。但是iMSC更适用于何种疾病类型,以及是否具有潜在的风险均未被充分阐明。本研究利用公共数据库中的高通量测序数据,将iMSC与骨髓源的MSC(BM-MSC)、脂肪源的MSC(AD-MSC)和脐带源的MSC(UC-MSC)进行对比,通过不同生物信息学方法,包括差异表达基因分析、功能富集分析、蛋白质相互作用网络分析及CMap数据库筛选,结果表明,iMSC具有独特的基因转录特征,与3种常用的MSC在基因表达上存在显著差异,特别是在神经、肌肉发育和免疫调节相关基因表达上;差异基因的功能富集分析进一步证实,iMSC在神经相关疾病治疗中表现出潜在优势,同时具有较低的免疫原性,但也存在较高的成瘤性风险;通过CMap数据库分析,识别了可能抑制iMSC成瘤性的基因靶点和小分子抑制剂,为降低iMSC应用风险提供了可能的策略。综上所述,iMSC作为细胞治疗的潜在来源,在神经疾病治疗中具有潜在优势,但其安全性需通过更多实验和临床研究来验证。

2种诱导iPSC向神经干细胞分化方法的比较

目的:整体比较2种促进诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSC)向神经干细胞(neural stem cells,NSC)分化的方法,确定一种稳定、高效的获得NSC的方法,并对NSC进行系统鉴定。方法:方法A:SB431542和drosomophorin的浓度均为5μmmol/L,诱导初始密度100%;方法 B:SB431542的浓度为5 mmol/L,drosomophorin的浓度为1 mmol/L,诱导初始密度为40%。比较及鉴定方法:镜下观察诱导获得NSC的状态;realtime PCR比较神经干细胞相关基因Pax6、nestin、Sox1、Sox2等表达量;流式细胞术分析诱导第16天Pax6阳性率;免疫荧光定性分析神经干细胞相关蛋白的表达及其自发分化的能力。结果:方法 A获得的NSC悬起后成球趋势明显,圆形,透明;方法 B诱导获得NSC形状不规则,色灰暗。Real-time PCR结果证明方法 A诱导获得的细胞神经干细胞相关基因的表达量高于方法 B。流式细胞术分析证明第16天,PAX6的阳性率,方法 A高于方法 B。经鉴定,方法 A获得的神经干细胞高表达Pax6、nestin、Sox2等基因自发分化30 d,形成明显的神经纤维束,表达TUJ-1、MAP2及GFAP等神经元和胶质细胞的特异性标志物。结论:方法 A整体优于方法 B,我们推荐方法 A作为诱导i PSC向神经干细胞分化的方法。

人诱导多能干细胞来源功能性胰岛β细胞的体外定向分化方法的建立

1型糖尿病是由胰岛β细胞功能受损、胰岛素分泌不足所致,目前,主要通过外源性胰岛素补充来治疗,但外源性胰岛素无法精准调控血糖,严重低血糖可危及生命。胰岛移植是一种替代疗法,但面临器官供体不足和异种来源胰岛β细胞存在人畜共患病交叉感染风险的问题。因此,获得足量且安全的胰岛β细胞是1型糖尿病细胞治疗面临的难题。本研究旨在通过人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)在体外向胰岛β细胞分化,提供一种潜在的1型糖尿病治疗新策略。为实现这一目标,我们采用了结合2D和3D培养系统的分化策略,模拟胰岛β细胞的体内发育环境,并使用多种生长因子调节在胰腺发育和β细胞分化中发挥重要作用的关键信号包括Notch信号通路(Notch signaling pathway)、Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)、TGF-β/Smad信号通路(TGF-β/Smad signaling pathway)等,在体外将hiPSC定向诱导分化至胰岛β细胞。结果显示,在2D、3D结合的培养条件下,分化过程中定型内胚层细胞,胰腺祖细胞,胰腺内分泌细胞及胰岛β细胞阶段的特异性基因的表达显著提高(P<0.05),并在胰岛素含量及葡萄糖刺激后表现出显著增强的胰岛素分泌能力(P<0.05)。总之,本研究成功建立了一种从hiPSC到功能性胰岛β细胞的分化策略,为1型糖尿病提供了一种新的细胞治疗途径。这种方法不仅为研究胰岛β细胞的发育生物学提供了新的工具,也为临床应用提供了一种潜在的胰岛β细胞来源,有望解决现有治疗方法的局限性。

非人灵长类多能干细胞体外培养和诱导分化的研究进展

干细胞在疾病发生、细胞治疗、药物筛选和临床应用等方面具有巨大价值。自日本科学家Shinya Yamanaka发现诱导多能干细胞以来,相关的研究立即成为研究热点并持续至今。小鼠干细胞的研究为其它动物的相关研究开辟了道路,但在药物筛选和疾病治疗等方面有很大局限性。非人灵长类与人类具有更高的基因同源性,在生理、病理、生殖、药理、神经等多方面与人类高度相似,是研究人类疾病和开发人用药物的理想动物模型。非人灵长类研究也是新药在进入临床实验前必须的一个环节。非人灵长类干细胞的研究在疾病的机理研究和药物开发中越发重要,同时避免了伦理问题。本文从体外培养系统的优化和诱导分化的方法两个方面对非人灵长类多能干细胞的相关研究进行了综述,以期为非人灵长类干细胞进一步深入研究提供参考。

基于人诱导多能干细胞的组织工程化软骨再生

目的:构建一种稳定高效的人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)向软骨中胚层方向分化的培养方法,初步探究hiPSCs来源的软骨用于关节软骨再生的可能。方法:通过模拟体内发育过程和三维(three dimensions,3D)悬浮培养体系,逐步诱导hiPSCs向软骨中胚层和成熟的软骨组织分化;利用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、蛋白质印迹法(Western blotting)、免疫荧光及免疫组织化学技术检测整个培养过程中多能干性、中胚层及软骨相关基因和蛋白的动态变化;最后利用裸鼠皮下模型研究hiPSCs软骨球软骨表型的稳定性及成瘤性。结果:通过模拟体内发育过程,成功逐步诱导hiPSCs向软骨中胚层方向分化,最终分化为成熟的软骨组织。结论:本研究成功构建了一种稳定高效诱导hiPSCs向软骨中胚层方向分化的培养体系,为探究hiPSCs介导的软骨组织发育和再生提供了一个研究平台。

人诱导多能干细胞来源细胞治疗产品的临床前安全性评价研究进展

干细胞作为再生医学的重要手段与研究核心,在临床重大难治性疾病治疗方面显现出巨大的应用价值。其中,诱导多能干细胞因其供体细胞限制少、质量稳定、伦理限制较少等优势,应用越来越广泛。尤其是多能干细胞定向分化技术和基因编辑技术等的逐步成熟,极大地加速了诱导多能干细胞衍生细胞疗法的发展。由诱导多能干细胞衍生分化的细胞治疗产品在非临床研究中证实了有效性和安全性,但诱导多能干细胞是通过人体来源的终端体细胞重编程而来,其衍生细胞产品的生产工艺与质量控制极为复杂,此类细胞产品应用到临床,仍然可能存在较大的安全性风险,例如成瘤性、异位分布、免疫排斥等潜在的风险。文章将介绍诱导多能干细胞及衍生细胞产品的基本概念和特点,并以治疗帕金森疾病的干细胞产品为例,着重探讨在非临床研究阶段可能存在的问题及采取的评价策略。

基于ClinicalTrials.gov及WHO ICTRP的中日诱导多能干细胞临床研究现状的比较研究

目的基于ClinicalTrials.gov和WHO ICTRP比较研究中日诱导多能干细胞(iPSC)的临床研究现状。方法检索ClinicalTrials.gov和WHO ICTRP平台,对建库至2024年3月中日iPSC临床试验数据进行采集,利用文献计量学方法,从注册数量、申办机构、疾病分类和研究类型及分期等角度,对中日该领域的临床试验注册现状进行比较研究。结果中国注册iPSC临床试验15项,日本53项;中日临床试验申办者均以高校、医院等科研院所为主,中国企业表现也较为活跃;中国临床试验覆盖的疾病范围小于日本;中日两国临床试验均以实验性研究为主。结论中国的iPSC技术还有较大的发展空间,未来发展需要进一步完善监管政策,建立严格的质量控制体系,合理规划和建设临床级i PS细胞库,综合高校、科研院所、企业三者iPSC研发与应用优势,加强资源合作,促进技术成果转化,推动技术的进步和应用的拓展。

利用人诱导多能干细胞构建心脏类器官方法的研究

目的:探索人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)分化为心脏类器官的方法。方法:首先通过免疫荧光染色验证hiPSCs多能性标志物的表达;之后将hiPSCs培养为拟胚体(embryoid bodies,EBs),利用双向调控WNT(wingless and Int-1,WNT)信号通路法诱导EBs向心脏类器官分化,记录分化过程中的形态变化。最后,通过免疫荧光染色、实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和微电极阵列(multi-electrode array,MEA)技术检测心脏类器官的细胞成分、基因表达谱、电生理特性和收缩舒张功能,验证心脏类器官分化方案的有效性。结果:免疫荧光染色显示hiPSCs中OCT4和SSEA4高表达。利用双向调控WNT信号的方法成功诱导hiPSCs产生跳动的心脏类器官。免疫荧光染色表明心脏类器官中cTNT阳性心肌细胞比例为(59.3±12.8)%,非心肌细胞比例为(40.7±12.8)%。qRT-PCR结果表明其中非心肌细胞包括平滑肌细胞、成纤维细胞及内皮细胞。与分化15D相比,分化30D的类器官中心肌成熟相关基因和心脏各项功能相关基因表达水平更高。MEA检测结果显示,随分化时间增加,类器官逐渐具备类似在体心脏的电生理特征,跳动频率减小[分化15d时跳动(58±5)vs.30d(38±5)次/min],收缩幅度增加15d时收缩幅度[(8.57±3.7)vs.30d(16.4±5.9)%]。结论:通过该方法能使hiPSCs分化出成熟且有功能的心脏类器官。

诱导性多潜能干细胞(iPS)的应用进展

诱导性多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS cells）自问世以来,取得了突飞猛进的发展。2006年8月,Takahashi和Yamanaka确定诱导iPS细胞生成的4种转录因子是：Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。2007年11-12月，日本的Yamanaka小组用这4种转录因子组合将人的体细胞重编程为iPS细胞。