诱导多能干细胞在遗传性心脏疾病模型中的应用与机制

背景:遗传性心脏病具有较高的患病率及死亡率,至今其发病机制仍未阐明。尽管部分遗传性心脏病已经建立了相应的动物模型,为研究遗传性心脏病的发病机制提供了一定的基础,但是由于物种间的差异等原因显著降低了这些研究结果的价值,因此,需要全新的模型来探索其发生发展过程。目的:综述了目前诱导多能干细胞在构建多种遗传性心脏病模型中的作用和潜在的应用前景。方法:第一作者于2023年1-3月期间应用计算机在Pub Med数据库中检索近13年的相关文献,以“induced pluripotent stem cell,inherited heart disease,congenital heart disease”等为检索词,最终纳入76篇文献进行分析。结果与结论:自2007年诱导多能干细胞从人体体细胞中诱导建立以来,已有许多针对疾病特异性诱导多能干细胞的研究报道。由于疾病特异性诱导多能干细胞能够再现疾病表型,因此有望成为体外疾病建模的一种新研究工具,用于分析发病机制和研制辅助药物。在心血管遗传性疾病的研究方面,从患者特异性诱导多能干细胞分化得到的心肌细胞中含有参与心脏发育异常相关的基因突变,因此,其可作为一种全新的工具研究遗传性心脏病的潜在机制。到目前为止,诱导多能干细胞来源心肌细胞已被广泛用于多种遗传性心脏疾病的分子机制研究,如心脏电生理性疾病、心肌病以及一些综合征性遗传性心脏疾病。

人诱导多能干细胞来源功能性胰岛β细胞的体外定向分化方法的建立

1型糖尿病是由胰岛β细胞功能受损、胰岛素分泌不足所致,目前,主要通过外源性胰岛素补充来治疗,但外源性胰岛素无法精准调控血糖,严重低血糖可危及生命。胰岛移植是一种替代疗法,但面临器官供体不足和异种来源胰岛β细胞存在人畜共患病交叉感染风险的问题。因此,获得足量且安全的胰岛β细胞是1型糖尿病细胞治疗面临的难题。本研究旨在通过人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)在体外向胰岛β细胞分化,提供一种潜在的1型糖尿病治疗新策略。为实现这一目标,我们采用了结合2D和3D培养系统的分化策略,模拟胰岛β细胞的体内发育环境,并使用多种生长因子调节在胰腺发育和β细胞分化中发挥重要作用的关键信号包括Notch信号通路(Notch signaling pathway)、Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)、TGF-β/Smad信号通路(TGF-β/Smad signaling pathway)等,在体外将hiPSC定向诱导分化至胰岛β细胞。结果显示,在2D、3D结合的培养条件下,分化过程中定型内胚层细胞,胰腺祖细胞,胰腺内分泌细胞及胰岛β细胞阶段的特异性基因的表达显著提高(P<0.05),并在胰岛素含量及葡萄糖刺激后表现出显著增强的胰岛素分泌能力(P<0.05)。总之,本研究成功建立了一种从hiPSC到功能性胰岛β细胞的分化策略,为1型糖尿病提供了一种新的细胞治疗途径。这种方法不仅为研究胰岛β细胞的发育生物学提供了新的工具,也为临床应用提供了一种潜在的胰岛β细胞来源,有望解决现有治疗方法的局限性。

基于诱导多能干细胞治疗急性心肌梗死的临床前研究进展

诱导多能干细胞(iPSC)是通过导入外源基因或在培养基中加入化学物质等方法使体细胞去分化而获得。与胚胎干细胞类似,iPSC可以分化形成三种胚层细胞系。iPSC能通过二维分化方法(如单层细胞培养和共培养),或拟胚体诱导法和基于支架的三维细胞培养方法分化为心肌细胞。iPSC分化成心肌细胞的过程还需通过激活或抑制特定的信号通路(如Wnt、BMP、Notch信号通路)来模拟体内心脏发育过程。近年来,通过生物反应器进行细胞悬浮培养,已能产生足够数量的iPSC衍生的心肌细胞(iPSC-CM)。iPSC-CM在移植前需要通过代谢调节和细胞分选等方法进行纯化,以消除可能导致畸胎瘤形成的未分化iPSC。目前,iPSC-CM的主要移植方法为细胞悬液注射和细胞片移植。动物实验研究表明,将iPSC-CM移植到梗死心肌中能改善心脏功能。本文综述了上述关于iPSC-CM治疗急性心肌梗死的临床前相关研究,并讨论了iPSC-CM在临床应用中的局限性和挑战,以期为iPSC-CM的临床转化研究提供参考。

诱导多能干细胞来源自然杀伤细胞的生物学特性

目的:利用诱导多能干细胞(iPSCs)建立体外扩增分化体系并进一步诱导分化为自然杀伤(NK)细胞。探讨iPSCs来源分化体系诱导分化来的NK细胞的生物学特性。方法:获取iPSCs,通过流式细胞术检测细胞分化功能的水平。结果:iPSCs经扩增和筛选,最后获得了可稳定未分化增殖的iPSCs,利用iPSCs成功分化NK细胞。结论:利用iPSC源分化体系成功在体外诱导出NK细胞,可产生大于90%CD45^(+)CD56^(+)细胞,有统计学差异(P<0.05)。NK细胞分化基本完全完成。其免疫表型的比例差异提示iPSCs-NK细胞具有不同的生物学特性。

利用人类诱导性多能干细胞有望治疗胱氨酸病婴儿

据Thiyagarajan R 2023年11月30日[Int J Mol Sci,2023,24(23):17004-17004.]报道,美国布法罗大学的研究人员发现了肾脏一个关键组成部分的生成过程中出现的错误是如何导致婴儿胱氨酸病(又称肾病性胱氨酸病)的。作为一种罕见疾病,婴儿胱氨酸病会极大地缩短患儿的寿命。

面肩肱肌营养不良症患者外周血单个核细胞来源的诱导多能干细胞的构建及骨骼肌分化

目的建立并鉴定面肩肱肌营养不良症(FSHD)患者外周血单个核细胞(PBMC)来源的诱导多能干细胞(iPSCs),初步探讨其骨骼肌分化能力,评估该细胞模型应用于疾病机制研究的可行性。方法收集1例FSHD患者的PBMC,用含4个重编程转录因子(OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC)的仙台病毒感染PBMC并获得FSHD患者来源的iPSCs,继续诱导其骨骼肌分化。通过基因组光学图谱技术、核型、免疫荧光染色、实时荧光定量PCR等分析iPSCs和骨骼肌细胞特性。结果成功获得FSHD患者来源的iPSCs,其可表达多能干性标记。FSHD-iPSC核型及D4Z4拷贝数结果与患者的临床背景一致,并在体外可定向诱导分化为骨骼肌细胞,该细胞同时表达DUX4致病基因以及调节基因。结论FSHD患者来源的PBMC可重编程为iPSCs,FSHD-iPSC可分化为疾病相关的肌源组细胞及肌管细胞,为FSHD发病机制的体外研究提供了良好的细胞模型,并为寻找该病的有效治疗手段提供了工具。

诱导多能干细胞瘤变的研究进展

诱导多能干细胞(IPSC)是体细胞重编程后得到的与胚胎干细胞相似的具有自我更新和多向分化潜能的细胞,这一发现成功避开了胚胎干细胞的伦理问题。自IPSC问世,这项技术就迅速应用于疾病建模、药物开发、再生医学和基因调控,尤其是再生医学自体移植研究领域。但是,IPSC移植后瘤变成为IPSC用于再生医学的一大阻碍,因此IPSC的瘤变成为当前IPSC研究的热点问题。本文就IPSC与肿瘤细胞的关系、IPSC移植后成瘤机制、降低IPSC移植后瘤变率以及IPSC移植后体内监测技术等几个方面进行简要综述。

毛蕊异黄酮对人诱导多能干细胞内皮分化的影响及机制

背景:内皮损伤是心血管疾病的诱因之一,人诱导多能干细胞易于获得、分化能力强、排异性较小,其内皮分化细胞可被用作心血管疾病研究的理想细胞。目的:探讨毛蕊异黄酮对人诱导多能干细胞定向内皮分化的作用及机制,为微血管再生提供技术支持。方法:将人诱导多能干细胞分为对照组与毛蕊异黄酮1.25,2.5μg/mL组,进行内皮定向诱导分化。诱导分化8 d后,采用流式细胞术检测各组细胞内皮细胞标志物CD144阳性率,免疫荧光技术检测CD144、CD31荧光表达。利用慢病毒RNAi-GFP puromycin沉默人诱导多能干细胞Piezo1 mRNA,再进行内皮定向诱导分化,诱导分化8 d后,采用流式细胞术检测分化细胞CD144阳性率,qPCR检测CD144、Piezo1、MEK的mRNA表达水平。结果与结论:①与对照组相比,毛蕊异黄酮1.25,2.5μg/mL组CD144阳性率显著升高(P<0.05);毛蕊异黄酮2.5μg/mL组CD144、Piezo1、MEK mRNA表达水平提高(P<0.05);毛蕊异黄酮2.5μg/mL组CD144(P<0.01)和CD31(P<0.001)荧光表达显著升高;②与shNT组相比,shNT+毛蕊异黄酮1.25,2.5μg/mL组CD144阳性率和CD144、Piezo1、MEK mRNA表达显著升高(P<0.05),与shPiezo1组相比,shPiezo1+毛蕊异黄酮1.25,2.5μg/mL组CD144阳性率和CD144、Piezo1、MEK mRNA表达无显著变化(P>0.05);③实验结果提示2.5μg/mL毛蕊异黄酮能够促进人诱导多能干细胞内皮分化,毛蕊异黄酮可以通过靶向调节Piezo1表达水平,促进下游MEK表达,从而促进人诱导多能干细胞内皮分化。

哺乳动物多能干细胞:在创建疾病模型、发病机制、药物发现和个性化治疗中的作用

背景:多能干细胞的自我更新和多向分化的特征有可能彻底改变人们对生物学、医学、发育和疾病的理解。干细胞在胚胎发育的早期发挥着重要作用,研究干细胞可以深入理解生物体发育和组织器官形成的基本原理,探索各种疾病的潜在机制,研究受损组织和器官的修复和再生,以及推动药物发现和个性化治疗。目的:回顾多能干细胞的研究历程,并对多能干细胞的基本类别进行归纳总结,同时阐述常见哺乳动物中各类多能干细胞的建系情况。方法:应用计算机检索PubMed、Web of Science、中国知网和万方数据库,检索词为“多能干细胞,胚胎干细胞,诱导多能干细胞,扩展多能干细胞,家畜多能干细胞,Pluripotent stem cells,Embryonic stem cells,Induced pluripotent stem cells,Expanded potential stem cells,Livestock pluripotent stem cells等”,根据纳入标准和排除标准系统地筛选与哺乳动物多能干细胞相关的文献99篇进行综述分析。结果与结论:(1)小鼠胚胎干细胞经典理论认为,干细胞的多能态分为“初始”(na?ve)态和“始发”(primed)态两种,na?ve态对应于早期胚胎未植入子宫壁前的囊胚内细胞团;primed态对应于植入后的上胚层,二者在表观遗传特征、转录活性、外部信号依赖性和代谢表型等方面存在显著的特征差异;后来研究发现在初始态和始发态之间,还存在一个过渡状态——“形成态”(formative态);事实上,胚胎干细胞的多能性属于连续阶段的发展进程,而不是某种独立的细胞状态。(2)除了从囊胚内细胞团获得多能干细胞之外,还有多种多能干细胞获得方式和建系方法:如利用来源于小鼠胎儿原始生殖细胞所建立的胚胎生殖干细胞;利用Oct3/4,Sox2,c-Myc和Klf4因子诱导成年小鼠和人的成纤维细胞去分化所建立的诱导多能干细胞;体细胞核移植,孤雌激活,以及从新生或成体睾丸组织或卵巢组织中分离并进行类胚胎干细胞培养所建立的胚胎干细胞样细胞系;来源于多种成体组织的极小胚胎样干细胞和来源于前囊胚期的扩展多能干细胞,这些多能干细胞的共同特征为不断自我更新,表达核心多能因子,并具备原始三胚层分化能力。(3)目前,多能干细胞正在被用于疾病建模,以便研究不同疾病的机制并开发新的药物。同时,科学家正在尝试用多能干细胞培养各种组织和器官,为再生医学和移植提供新的可能性。然而,多能干细胞的临床应用面临着安全性挑战,包括细胞畸变和免疫排斥问题。不断改进多能干细胞的产生方法,将使其更安全、高效地适用于临床。(4)借鉴小鼠和人多能干细胞的获得方式和建系方法,研究者们已经在家畜中建立了各类多能干细胞,包括胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、生殖细胞谱系的多能干细胞和扩展多能干细胞,这将为动物繁殖育种、基因工程、疾病模型、新药筛选和野生濒危动物保护提供新的途径。

诱导多能干细胞来源的间充质干细胞的治疗潜力与应用风险

诱导多能干细胞衍生的间充质干细胞(iMSC)已被提出作为原代间充质干细胞(MSC)的替代来源,在疾病治疗相关研究中也显示出多种优势。但是iMSC更适用于何种疾病类型,以及是否具有潜在的风险均未被充分阐明。本研究利用公共数据库中的高通量测序数据,将iMSC与骨髓源的MSC(BM-MSC)、脂肪源的MSC(AD-MSC)和脐带源的MSC(UC-MSC)进行对比,通过不同生物信息学方法,包括差异表达基因分析、功能富集分析、蛋白质相互作用网络分析及CMap数据库筛选,结果表明,iMSC具有独特的基因转录特征,与3种常用的MSC在基因表达上存在显著差异,特别是在神经、肌肉发育和免疫调节相关基因表达上;差异基因的功能富集分析进一步证实,iMSC在神经相关疾病治疗中表现出潜在优势,同时具有较低的免疫原性,但也存在较高的成瘤性风险;通过CMap数据库分析,识别了可能抑制iMSC成瘤性的基因靶点和小分子抑制剂,为降低iMSC应用风险提供了可能的策略。综上所述,iMSC作为细胞治疗的潜在来源,在神经疾病治疗中具有潜在优势,但其安全性需通过更多实验和临床研究来验证。

基于人诱导多能干细胞的组织工程化软骨再生

目的:构建一种稳定高效的人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)向软骨中胚层方向分化的培养方法,初步探究hiPSCs来源的软骨用于关节软骨再生的可能。方法:通过模拟体内发育过程和三维(three dimensions,3D)悬浮培养体系,逐步诱导hiPSCs向软骨中胚层和成熟的软骨组织分化;利用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、蛋白质印迹法(Western blotting)、免疫荧光及免疫组织化学技术检测整个培养过程中多能干性、中胚层及软骨相关基因和蛋白的动态变化;最后利用裸鼠皮下模型研究hiPSCs软骨球软骨表型的稳定性及成瘤性。结果:通过模拟体内发育过程,成功逐步诱导hiPSCs向软骨中胚层方向分化,最终分化为成熟的软骨组织。结论:本研究成功构建了一种稳定高效诱导hiPSCs向软骨中胚层方向分化的培养体系,为探究hiPSCs介导的软骨组织发育和再生提供了一个研究平台。

利用人诱导多能干细胞构建心脏类器官方法的研究

目的:探索人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)分化为心脏类器官的方法。方法:首先通过免疫荧光染色验证hiPSCs多能性标志物的表达;之后将hiPSCs培养为拟胚体(embryoid bodies,EBs),利用双向调控WNT(wingless and Int-1,WNT)信号通路法诱导EBs向心脏类器官分化,记录分化过程中的形态变化。最后,通过免疫荧光染色、实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和微电极阵列(multi-electrode array,MEA)技术检测心脏类器官的细胞成分、基因表达谱、电生理特性和收缩舒张功能,验证心脏类器官分化方案的有效性。结果:免疫荧光染色显示hiPSCs中OCT4和SSEA4高表达。利用双向调控WNT信号的方法成功诱导hiPSCs产生跳动的心脏类器官。免疫荧光染色表明心脏类器官中cTNT阳性心肌细胞比例为(59.3±12.8)%,非心肌细胞比例为(40.7±12.8)%。qRT-PCR结果表明其中非心肌细胞包括平滑肌细胞、成纤维细胞及内皮细胞。与分化15D相比,分化30D的类器官中心肌成熟相关基因和心脏各项功能相关基因表达水平更高。MEA检测结果显示,随分化时间增加,类器官逐渐具备类似在体心脏的电生理特征,跳动频率减小[分化15d时跳动(58±5)vs.30d(38±5)次/min],收缩幅度增加15d时收缩幅度[(8.57±3.7)vs.30d(16.4±5.9)%]。结论:通过该方法能使hiPSCs分化出成熟且有功能的心脏类器官。

Pcgf2促进鸡胚成纤维细胞重编程形成诱导多能干细胞

【目的】以提高诱导鸡多能干细胞的干性为目的,利用Pcgf2基因与传统诱导多能干细胞的重编程因子共同诱导鸡多能干细胞。【方法】以鸡早期胚胎为模板,对Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、C-myc、Klf4这6种传统的重编程因子及Pcgf2进行基因扩增,并与慢病毒载体重组为慢病毒质粒,在包装慢病毒并测定相对应的病毒滴度后,分组感染鸡胚成纤维细胞,在诱导的过程中对干细胞标记物进行检测。【结果】利用传统的重编程因子组合与加入Pcgf2共同诱导后的细胞都较早地表达出磷酸酶活性。加入Pcgf2诱导多能干细胞可以使细胞更早地出现类干细胞形态,且内源性基因Oct4、Sox2、Nanog和Lin28的表达得到更稳定的提高。【结论】Pcgf2在加入诱导体系后可以有效提高细胞的重编程接近干细胞状态。该研究可为选择重编程因子诱导鸡细胞完全重编程及其机制研究提供理论参考。

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞研究进展

心血管疾病(CVD)是全球第一大致死疾病,各种CVD的临床终末阶段为心力衰竭。心脏移植是无禁忌证晚期心力衰竭患者的首选治疗方法^([1])。然而,心脏移植面临着供者不足、免疫排斥等诸多困难。人诱导多能干细胞(hiPSC)的出现为再生医学提供了可能,且避免了胚胎干细胞(ESC)引起的伦理问题,因而受到广泛关注。

人尿源性干细胞的分离培养及诱导分化为平滑肌细胞

背景:传统尿路修复重建手段受限于供体短缺、并发症多以及生理功能恢复不理想等问题,组织工程策略为此领域提供了新方向。鉴于尿路主要由肌性组织构成,其中关键在于发掘适合的种子细胞并高效诱导分化为平滑肌细胞,但关于不同平滑肌细胞诱导方案效能的对比研究仍较为匮乏。目的:旨在分离、培养及鉴定人尿源性干细胞,并比较两种不同成平滑肌诱导方案的效果。方法:采用多次离心法从11份健康成人志愿者尿液中分离提取尿源性干细胞,使用流式细胞仪进行表面标志物的鉴定,通过成骨、成脂诱导分化来验证尿源性干细胞的多向分化潜能。尿源性干细胞分别在含转化生长因子β1以及转化生长因子β1联合血小板衍生生长因子的成平滑肌细胞诱导分化培养基中诱导分化14 d,采用免疫荧光染色和Western blot检测平滑肌特异性蛋白(α-SMA、SM22)的表达差异。结果与结论:①成功从8份健康人尿液中分离出尿源性干细胞,细胞呈“米粒”样,具有很好的分裂增殖能力;②尿源性干细胞高表达间充质干细胞表面标志物CD73、CD90和CD44,极低表达造血干细胞表面标志物CD34和CD45,不表达CD19、CD105和HLA-DR;③经成骨和成脂诱导分化后,可见明显的钙结节和脂滴形成,茜素红染色和油红O染色结果呈阳性;④成平滑肌诱导培养14 d,免疫荧光染色显示转化生长因子β1/血小板衍生生长因子组尿源性干细胞成平滑肌诱导分化率显著高于转化生长因子β1组(P<0.005);⑤成平滑肌诱导培养14 d,Western blot检测显示转化生长因子β1/血小板衍生生长因子组α-SMA和SM22蛋白表达量显著高于转化生长因子β1组(P<0.005)。结果表明:尿源性干细胞可以通过多次离心法无创分离获取;相较于单纯转化生长因子β1,转化生长因子β1/血小板衍生生长因子联合应用能显著提高尿源性干细胞诱导分化为平滑肌细胞的效率。

ANO5非移码插入突变型GDD家系临床分析及其诱导多能干细胞的构建

目的:建立和鉴定临床发现的一个由ANO5基因新的致病性突变引起的颌骨骨干发育不良(gnathodiaphyseal dysplasia,GDD)家系中患病者和非患病者来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)。方法 :纳入以颌骨畸形为主要表现的1个GDD家系5例患者,评估患者临床表现、骨影像学、骨密度、骨量等相关生化指标。收集家系中1例患病者与非患病者外周血样本,将表达Oct4、Sox2和Klf4转录因子的仙台病毒转染患病者和非患病者外周血单核细胞,将其重编程为i PSCs,并通过碱性磷酸酶染色、细胞免疫荧光、qPCR、核型分析等检测其干细胞多能性。结果:GDD主要表现为双侧上下颌骨弥漫性多发肿胀,并伴有全身骨密度下降。通过检测,证明患病者及非患病者外周血来源的i PSCs具有多能性。结论:GDD患者外周血单核细胞在体外可被成功诱导为无外源性基因整合的具有多能分化特性的i PSCs,为GDD的发病机制研究提供了高效直接的细胞模型。

Rho激酶抑制剂Y27632促进人诱导多能干细胞来源原始神经上皮细胞向多巴胺能神经前体细胞的转化

目的提高人诱导多能干细胞来源原始神经上皮细胞(hiPSCs-NECs)定向诱导中脑多巴胺能神经前体细胞(DAPs)的效率。方法将人iPSCs在含有小分子组合[DMH1(10μmol/L)、SB431542(10μmol/L)、音猬因子(SHH 200 ng/mL)、成纤维细胞生长因8(FGF8100 ng/mL)、嘌吗啡胺(2μmol/L)、CHIR99021(3μmol/L)、N2(1%)]的mTeSRTM培养基中诱导至12 d,细胞分化为原始神经上皮细胞(NECs)。特异性诱导DAPs,将诱导的hiPSCs-NECs用胶原酶IV消化后,在神经分化培养基[添加1%N2、2%B27-A、BDNF(10 ng/mL)、GDNF(10 ng/mL)、AA、TGF-β、cAMP、1%GlutaMax]中加入不同浓度的Rho激酶抑制剂Y27632重新接种,并于次日更换培养基去除Y27632,持续诱导至第28天获得DAPs。结果人iPSCs可在基质胶上稳定传代,表达多潜能性标记物OCT4、SOX2、Nanog和SSEA1,且碱性磷酸酶染色呈阳性。诱导分化至第13天获得hiPSCs-NECs,形成玫瑰花结样结构,能够表达特征性标记物(SOX2、Nestin和PAX6)。将hiPSCs-NECs消化后,添加5μmol/LY27632的hiPSCs-NECs相比较未加Y27632的对照组,细胞解离后贴壁存活率明显增加,处于S期的细胞(P<0.01)与细胞活力显著提高(P<0.01),且凋亡率显著降低(P<0.05),持续诱导至第28天,细胞高表达DAPs特异性的标记物(TH、FOXA2、NURR1和Tuj1)。结论添加Y27632(5μmol/L)24 h可显著提高人iPSCs-NECs细胞向iPSCs-DA神经前体转化时的细胞存活率,并且Y27632去除后,不会影响后续向DA神经前体细胞分化,间接的提高了细胞的分化效率.

诱导性多能干细胞(iPSCs)在牙再生中的应用

干细胞能够自我更新并分化成各类组织细胞,在再生医学中具有很大的应用潜力。随着组织工程的快速发展,以胚胎干细胞和组织干细胞为基础的牙再生技术有待成为替代缺失牙的一种重要方法,然而免疫排斥和伦理的争议等问题为干细胞的临床应用带来很大的困难。由自体细胞产生的诱导性多能干细胞的发现将为牙齿再生带来革命性变化。本文就诱导性多能干细胞的研究背景及其在再生医学和牙再生领域的应用进展作一综述。

人诱导多能干细胞来源的心脏前体细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死

目的探索人诱导多能干细胞来源的心脏前体细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的效果。方法利用免疫荧光染色鉴定人诱导多能干细胞的多能性,利用GiWi法在体外将其分化为心脏前体细胞,再继续分化为心肌细胞,利用流式细胞术及免疫荧光染色对所获得的心脏前体细胞和心肌细胞进行分化效率及形态学鉴定。通过结扎大鼠冠状动脉左前降支制备急性心肌梗死模型,利用TTC染色、超声心动图评估造模情况。将心脏前体细胞移植到心肌梗死边缘区,术后1周、4周利用超声心动图检测心功能;利用HE、Masson染色评估梗死区域大小以及纤维化程度;利用免疫荧光染色评估心脏前体细胞的体内存活及分化情况。结果人诱导多能干细胞高表达干性标志物OCT4、SOX2、Nanog以及Tra-1-60。心脏前体细胞的体外分化效率高达77.8%,表达心脏前体细胞特异性标志物Isl1;并可进一步分化为心肌细胞,其效率高达83.3%,同时高表达cTnT、α-actinin等心肌特异性标志物。大鼠急性心肌梗死模型制备成功,TTC染色见梗死区发白,左室射血分数降低。体内移植后4周,与模型组相比,细胞组心功能改善明显,心室扩张减弱,纤维化减轻;移植细胞体内存活并分化为心肌细胞。结论人诱导多能干细胞来源的心脏前体细胞体外分化效率高,体内移植后可存活并分化为心肌细胞,可抑制心室重构,改善心功能。

神经营养素-3过表达诱导多能干细胞治疗糖尿病性勃起功能障碍大鼠的实验研究

目的 探讨神经营养素-3过表达诱导多能干细胞(iPSC-NT-3)对糖尿病性勃起功能障碍(DIED)大鼠的治疗作用。方法 腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型大鼠,皮下注射阿扑吗啡对DIED模型进行验证。选择24只造模成功的DIED大鼠,随机分为模型对照组、诱导多能干细胞(iPSC)治疗组和iPSC-NT-3治疗组;腹腔注射柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液的8只SD大鼠作为正常对照组。各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉,iPSC治疗组和iPSC-NT-3治疗组分别将iPSC和iPSC-NT-3用微量注射针注射入大鼠阴茎海绵体内,正常对照组和模型对照组同法注射同体积的磷酸缓冲液。治疗后第4周,观察各组大鼠的一般情况,评估性功能和阴茎勃起功能。采用定量聚合酶链反应(q-PCR)和Western blot实验检测神经营养素-3(NT-3)、CD31、血管内皮生长因子(VEGF)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、结蛋白(Desmin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白的表达。结果 治疗前和治疗后4周,模型对照组、iPSC治疗组和iPSC-NT-3治疗组大鼠体质量和血糖水平的组内、组间差异均无统计学意义(P>0.05)。在大鼠首次爬背时间比较中,模型对照组较正常对照组延长,iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组缩短,iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组缩短,差异均有统计学意义(P<0.05);在舔嗅次数、骑跨次数和插入次数的比较中,模型对照组均较正常对照组减少,iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组增加,iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。在ICP和ICP/MAP的比较中,模型对照组较正常对照组降低,iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组升高,iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。在大鼠阴茎海绵体NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin和α-SMA的mRNA表达水平比较中,模型对照组较正常对照组降低,iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组升高,iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。在大鼠阴茎海绵体NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin、α-SMA蛋白水平比较中,模型对照组较正常对照组降低,iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组升高,iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 iPSC-NT-3可通过促进海绵体组织eNOS、血管内皮及平滑肌的生成而改善DIED大鼠的性功能和勃起功能,是一种潜在的治疗DIED的方法。