乳源性免疫活性肽在E.coli BL21中分泌表达的诱导条件优化

设计4个乳源性免疫活性肽的目的基因后,利用基因重组技术成功构建原核表达载体pTYB11,并将重组质粒转化到E.coli BL21中,通过改变异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的浓度、培养时间和培养温度,设计正交试验来优化乳源活性小肽的IPTG诱导表达条件,使目的蛋白可在E.coli BL21中高效表达。依据15%SDS-PAGE电泳分析得到融合蛋白的表达量,选出最适诱导条件为IPTG终浓度0.1～0.2mmol/L,在12～15℃条件下培养20h,得到大小为59.2kD左右的融合目的蛋白,其表达量可占总蛋白表达量的40%,经Western Blotting鉴定正确。

重组褐藻胶裂解酶表达体系的构建及诱导条件优化

目的对褐藻胶裂解酶基因aly-cob进行外源表达,并优化诱导条件以实现褐藻胶裂解酶的高效表达。方法以产褐藻胶裂解酶菌株Cobetia sp.WG-007为出发菌株,对克隆得到的褐藻胶裂解酶基因进行稀有密码子改造,构建重组质粒pET-28a(+)-aly-cob,在宿主Escherichia coli BL21pLysS中进行诱导表达,对发酵培养基、异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、诱导温度、诱导时机、诱导浓度及诱导时间进行系统优化以提高酶活。结果构建了重组菌E.coli BL21pLysS/pET-28a(+)?aly-cob,最适培养基为SB培养基,最佳诱导条件为OD600为1.0时加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG,在22℃下诱导24h后酶活可达2 403.93U/mL。结论成功对优化后的褐藻胶裂解酶基因aly-cob进行外源表达,经诱导表达条件优化后酶活为野生菌酶活的15倍,更具有工业化应用的潜力。

重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-S12表达头孢菌素酰化酶的诱导条件优化

头孢菌素酰化酶AcyⅡ可以直接水解CPC生成7-ACA,后者是重要的医药中间体,用来合成头孢类抗生素。头孢菌素酰化酶S12是AcyⅡ的突变体,其催化效率比AcyⅡ高。本文通过优化头孢菌素酰化酶S12在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达条件,为确定周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺奠定基础。利用单因素和正交设计对装液量、接种量、诱导时间,诱导温度和IPTG浓度等发酵条件进行了考察。单因素结果表明:装液量为25mL/250mL三角瓶,接种量1%,指数生长开始加入0.05mM IPTG,28℃诱导20小时发酵液酶活最高;正交试验结果表明:装液量50mL/250mL三角瓶,接种量2%,指数生长开始加入0.05mM IPTG,诱导28℃且诱导24hours酶活最高,发酵液产酶水平达639.9U/L。方差分析结果显示,发酵时间和装液量对酶活影响极显著,诱导时机对酶活影响显著,接种量对酶活没有显著影响。验证实验发现,发酵液产酶水平最高可以达到802.9U/L。本实验为该工程菌的发酵研究提供了最佳的表达诱导条件,对下一步的研究具有指导意义。

雨生红球藻培养基筛选及诱导条件优化

目的:本文通过筛选有利于雨生红球藻营养生长的培养基,优化雨生红球藻内虾青素的积累条件。方法:选用7种培养基对4株雨生红球藻分别进行培养,同时筛选出最适于4种藻株营养生长的培养基。探究雨生红球藻在光胁迫、缺氧、高盐3种条件下诱导虾青素积累情况。结果:4个不同雨生红球藻藻株在配方A培养基中的生物量比其他6种试验培养基的生物量高1.54-6.29倍;在优势培养基配方A中,HP 3的生物量最大,可达到6.03×106个/mL;HP 3在缺氮的胁迫条件下,虾青素产量最高,可达到20.96mg/L,比光诱导获得的最佳虾青素产量高0.96倍,比高盐获得的最佳虾青素产量高1.53倍。结论:该研究中最适于试验藻株营养生长的培养基是配方A,当胁迫条件为缺氮9%时虾青素积累量最大。

基因重组大肠杆菌表达HrpNEcc蛋白的发酵条件及诱导条件优化

对已构建好的表达HrpNEcc蛋白的工程菌BL21(DE3)/pET30a(+)hrpNEcc的摇瓶发酵条件及乳糖诱导进行优化,通过在7L发酵罐中放大发酵实验,以期提高蛋白产量并降低生产成本。在摇瓶中优化的发酵及诱导条件是:5%的接种量,TB培养基,菌体培养至对数生长前期,添加3g/L外源诱导剂乳糖时,HrpNEcc蛋白产量可达417.60mg/L,比不添加乳糖时提高了36.73%,比用IPTG诱导时提高了16.85%。7L发酵罐中发酵,获得菌体湿重达到57.24g/L(WCW),可溶性HrpNEcc蛋白产量占细胞总蛋白的50.2%,为3.29 g/L。

产胆固醇氧化酶重组大肠杆菌的发酵培养基和诱导条件的优化

在摇瓶中对产胆固醇氧化酶重组大肠杆菌的发酵培养基和诱导条件进行了优化,优化培养基为甘油10 g/L,胰蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,KH2PO42 g/L,K2HPO44 g/L,Na2HPO4.12 H2O7 g/L,(NH4)2SO41.2 g/L,NH4Cl 0.2 g/L,MgSO4.7 H2O1 g/L;优化的诱导条件为:对数生长中期诱导,IPTG浓度为0.3 mmol/L。在优化的培养基和优化的诱导条件下,单位菌体产酶量达745.86 U/g,菌体产酶水平达1 625.97 U/L,为优化前的700 U/L的2.3倍。

屎肠球菌Ef2的安全性评估及其产生物胺氧化酶培养和诱导条件的优化

采用溶血实验、药敏实验、耐药基因和毒力基因PCR扩增对屎肠球菌Ef2进行安全性评估,实验结果表明,屎肠球菌Ef2溶血实验呈阴性,对庆大霉素、链霉素等不敏感,而对万古霉素等其他大部分抗生素抗菌药物敏感,无毒力基因检出,因此初步判定该菌株是安全的,可用作后续实验。通过单因素结合正交实验对该菌株产生物胺氧化酶的诱导培养基和培养条件进行优化,最后确定诱导培养基的最佳成分为:乳糖50 g/L、腐胺6 g/L、酵母膏8 g/L、MgSO_43 g/L、MnSO_40. 03 g/L、乙酸钠1. 5 g/L;最佳培养条件为:初始pH 7. 0、接种量0. 5%、培养时间36 h、培养温度32℃。生物胺氧化酶酶活力从诱导前的10. 9 U/mL提升至26. 12 U/mL,酶活力提高了139. 63%。研究结果表明,通过对培养和诱导条件的优化,可大幅度提升屎肠球菌Ef2产生物胺氧化酶的活力。

致病性鸡大肠杆菌pilA和外膜蛋白C原核诱导表达条件的优化

分别从温度、接菌量、诱导时机、IPTG浓度、诱导时间等条件对2种重组菌株BL21/pET-28a-pilA和BL21/pET-28a-ompC进行优化.得到最佳诱导条件:BL21/pET-28a-pilA菌株为40℃摇培,80μL的接菌量,160 r/min摇培2 h后加入终浓度为0.96 mmol/L的IPTG,再诱导表达4 h,得到最高特异蛋白表达量;BL21/pET-28a-ompC菌株为37℃培养,80μL的接菌量,160 r/min摇培2.5 h后加入终浓度为0.64 mmol/L的IPTG,再诱导表达6 h,得到最高特异蛋白表达量.

略阳乌鸡ɑ干扰素原核表达载体构建及诱导条件优化

为了探索略阳乌鸡α干扰素在大肠杆菌中高效表达的诱导条件,试验采用PCR获得略阳乌鸡α干扰素成熟肽段的编码区DNA序列,将其克隆至载体p ET-32a的HindⅢ和XhoⅠ位点间,并通过菌落PCR和测序鉴定获得的鸡α干扰素的原核表达载体p ET-32a-Ch IFN-α。将p ET-32a-Ch IFN-α转化至大肠杆菌Rosetta菌株,通过筛选获得阳性克隆,进而分别对诱导表达时间、诱导剂浓度等条件进行筛选,获得了略阳乌鸡α干扰素的最佳表达条件。结果表明:成功构建p ET32aCh IFN-α质粒和重组菌株,最适诱导表达条件为诱导温度37℃,诱导剂IPTG浓度0.2 mmol/L,诱导时间5 h,诱导时机OD600值为0.448时。说明构建略阳乌鸡α干扰素的原核表达菌株成功,并且实现了α干扰素的高效表达。

青海湖裸鲤IL-8的原核表达及诱导条件优化

白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)是一种CXC家族趋化因子,主要通过趋化炎症细胞参与机体免疫反应。本研究通过RT-PCR技术,扩增得到含一对酶切位点的青海湖裸鲤IL-8成熟蛋白DNA序列(gpIL-8),经酶切连接至pET30a(+)质粒得到原核表达重组质粒pET30a-gpIL-8,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21后成功诱导得到分子量约13.7 kD的重组蛋白,重组蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在。通过对影响蛋白表达量的诱导物浓度和诱导时间进行优化,发现包涵体重组蛋白表达量随诱导时间增加而增加,随诱导物浓度增加呈先增加后减少的趋势,在0.4 mmol/L IPTG诱导8 h时表达量最高。可溶性重组蛋白表达量总体上随诱导时间的增加呈先增加后减少趋势,随诱导物浓度的增加表达量无明显改变,在0.4 mmol/L IPTG诱导6 h时即可表达高浓度的可溶性重组蛋白。因可溶性蛋白有利于后续实验,故利用最佳诱导条件诱导后对可溶性蛋白进行纯化,得到高纯度的IL-8重组蛋白,测得浓度达101.5μg/mL,满足后续实验要求。本研究为青海湖裸鲤IL-8多克隆抗体制备,及其功能、作用机制研究提供了理论依据。

重组亚油酸异构酶诱导表达条件的优化

为了提高重组亚油酸异构酶的活力,试验对重组亚油酸异构酶诱导表达过程中的诱导时机、诱导时间、诱导剂浓度和诱导温度4个影响因素进行了研究,并进行了优化。正交试验表明,最佳诱导条件为:诱导时机为诱导前培养菌体7 h,诱导时间为10 h,诱导剂浓度为0.15 mM,诱导温度为30℃。最佳诱导条件下,诱导出的亚油酸异构酶的酶活力平均可达3 849.686 0 U/ml。结果显示,通过对诱导条件进行优化所得的亚油酸异构酶具有较高的酶活力。

重组大肠杆菌产谷氨酰胺转氨酶培养基及发酵条件优化

对已构建好的表达谷氨酰胺转氨酶的大肠杆菌Rosetta DE3的摇瓶培养条件及发酵条件进行优化,所获优化培养基配方为葡萄糖4.0g/L,酵母膏3.0g/L,NH4Cl 4.0g/L,Na2HPO42.0g/L,K2HPO41.0g/L,MgSO4.7H2O 1.0g/L,NaCl 3.0g/L。得菌株发酵培养的最佳优化条件为装液量为25mL,接种量为5%,加IPTG浓度为0.6mmol/L,诱导时间为4h。

重组大肠杆菌表达β-甘露聚糖酶的条件优化

目的:优化重组大肠杆菌表达β-甘露聚糖酶的条件;方法:利用单因素试验和正交试验,确定重组β-甘露聚糖酶表达的诱导温度、时间及p H;结果:最佳产酶条件为;诱导温度60℃,诱导时间7h,p H6.0。结论:表达优化条件稳定性好,可为后续的工业化生产奠定基础。

重组毕赤酵母产猪IFNα的诱导条件

采用Plackett-Burman实验设计,选取甲醇、酵母粉、蛋白胨、K2HPO4.12H2O、MgSO4、(NH4)2SO4、pH和PTM1这8个对重组猪IFNα表达量有影响的相关因子进行筛选,用SAS软件进行统计分析,分析表明:甲醇、蛋白胨以及K2HPO4.12H2O对重组猪IFNα表达量具有显著性影响;之后采用Box-Behnken设计及响应面分析法确定最佳的诱导条件。在最优条件下,重组猪IFNα表达量比优化前提高了2.46倍。

大肠杆菌表达腺苷蛋氨酸合酶及产酶条件优化

腺苷蛋氨酸(adenosymethionine,SAM)是人体中重要的代谢中间体,在医疗上被广泛应用于治疗肝炎,抑郁症以及关节炎等疾病。酶法进行腺苷蛋氨酸的生产具有良好的工业前景。将来源于酿酒酵母BY4741中的腺苷蛋氨酸合酶基因(sam2)进行密码子优化后,与p ET-28a(+)和p ET-3b(+)进行连接获得重组质粒p ET-28a(+)-sam2和p ET-3b(+)-sam2,分别实现其在E. coli BL21(DE3)和E. coli Rosetta(DE3)中的异源表达,结果表明,重组菌E. coli BL21/p ET-28a(+)-sam2的SAM酶活较高,达到0. 184 U/m L。对该重组菌株进行发酵条件优化,在最优条件下,SAM合酶最高酶活为0. 245 U/m L,比优化前提高34%。

重组大肠杆菌产双乙酰还原酶的发酵条件优化

光学纯2,3-丁二醇是重要的手性合成砌块。采用双乙酰还原酶催化还原双乙酰底物是一种合成光学纯2,3-丁二醇的绿色方法。作者在摇瓶中对产双乙酰还原酶重组大肠杆菌的发酵培养基及诱导条件进行了优化。优化后的发酵培养基组成为:甘油5 g/L,酵母浸膏10 g/L,鱼粉蛋白胨5 g/L,(NH_4)_2SO_41.5 g/L,柠檬酸钠5 g/L,KH_2PO_41 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.5 g/L,NaCl 2 g/L;优化后的诱导条件为37℃,IPTG终浓度为0.1 mmol/L。在优化培养基中,37℃和0.1 mmol/L IPTG条件下诱导发酵6 h,单位菌体(干重)产双乙酰还原酶量达13.84 kU/g,产酶水平达33.65kU/L,分别为基础培养基的2.04和4.23倍,LB培养基的1.16和1.71倍。在此最优条件,在3 L发酵罐中进行了重组大肠杆菌产双乙酰还原酶的验证,发酵8 h时酶活最高,单位菌体产双乙酰还原酶量达14.09 kU/g,产酶水平达64.62 kU/L。本研究为高效制备可用于不对称还原合成光学纯2,3-丁二醇的双乙酰还原酶奠定了基础。

化学分子伴侣及诱导条件协同强化Thermotoga maritimaα-葡聚糖磷酸化酶可溶性表达

为实现海栖热袍菌Thermotoga maritimeα-葡聚糖磷酸化酶的高效制备。构建了产α-葡聚糖磷酸化酶重组菌株,并对发酵条件进行了优化。初步研究发现,重组菌株在37℃条件下进行诱导培养,摇瓶发酵24 h,酶活力仅有5.2 U/mL;SDS-PAGE蛋白电泳显示,重组酶主要以不可溶的包涵体状态存在,可溶性酶所占比例偏低。为减少包涵体的形成、提高重组酶可溶性表达水平,分别从诱导条件和分子伴侣两个方面进行了优化。首先,通过对诱导剂种类、诱导剂浓度、温度、诱导剂添加时间等诱导条件进行优化后,α-葡聚糖磷酸化酶的酶活力提高到27.0 U/mL,是优化前的5.2倍。其次,通过添加化学分子伴侣进一步提高重组酶可溶性表达水平,发现在发酵0 h添加20 mmol/L的化学分子伴侣(肌醇)后,最高酶活力为62.0 U/mL,是优化前酶活力的11.9倍;然而,共表达5种分子伴侣质粒pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16对α-葡聚糖磷酸化酶的可溶性表达均没有促进作用。

南方红豆杉愈伤组织诱导研究

文章研究了从南方红豆杉的幼叶及幼茎,在MS、B5、N6及SH4种培养基上的诱导愈伤组织的情况,并对愈伤组织的诱导条件进行优化,结果表明以幼叶及幼茎作为外植体在MS培养基上产生愈伤组织的速度较快,7d即有愈伤组织发生,但愈伤组织也容易褐化;而B5和N6培养基愈伤组织机构紧密,褐化少。不同部位外植体诱导愈伤组织有差异,茎、叶容易诱导愈伤组织,根的诱导率差。外植体大小对于愈伤组织影响显著,带有部分叶的茎段不能够形成愈伤组织,带有根的茎段则可以诱导愈伤组织。

绵羊肺腺瘤病毒受体Hyal-2原核表达诱导条件的优化及其表达产物的鉴定

为了提高绵羊肺腺瘤病毒受体透明质酸酶-2(Hyal-2)在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量,试验对含pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒的BL21(DE3)重组菌原核表达条件进行了优化。结果表明:诱导剂IPTG浓度、作用时间、温度对目的蛋白的表达影响很大,在37℃条件下加入不同终浓度的IPTG(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L)对重组菌诱导4 h,在终浓度为0.4 mmol/L时目的蛋白的表达量最高;加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,在37℃条件下诱导,在不同时间点(2,4,6,8小时)取样,在作用时间为2 h,37℃条件下表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在,当温度降低时可溶性形式明显增加。通过对诱导条件的优化和摸索发现,绵羊肺腺瘤病毒受体Hyal-2原核表达在诱导剂IPTG浓度为0.4 mmol/L、作用时间为2 h、温度为37℃时目的蛋白的表达量最高。

极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达

海栖热袍菌Thermotogamaritima为嗜极端高温的厌氧细菌 ,其产生的极耐热性木聚糖酶B具有非常可观的工业应用前景。但编码该酶的基因xynB在大肠杆菌中的表达较困难。文中利用PCR技术将xynB克隆至原核表达载体pET 2 0b ,并与组氨酸标签进行融合构建成重组质粒 pET 2 0 xynB。研究发现 ,pET 2 0 xynB在稀有密码子AGA ,AGG和AUA得到加强的大肠杆菌宿主菌株BL2 1 CodonPlus(DE3 ) RIL中 ,木聚糖酶基因的表达水平远远高于在其他菌株中的表达。结合对重组菌的诱导条件的优化 ,使得重组蛋白表达量达到11 5 % ,比酶活达到 2 5 69U/mg ,比常规基因工程菌株提高 12 5倍。