pTWIN1-EgAgB8/3自剪切融合蛋白原核表达载体的构建及表达

目的表达获得较纯的细粒棘球绦虫AgB8/3重组抗原(rEgAgB8/3)。方法根据GeneBank登陆号(AF362442)下载目的基因核酸序列,利用DNAman软件设计引物,对EgAgB8/3编码分泌型多肽片段的核酸序列进行PCR扩增,测序鉴定其正确性后定向连入原核表达质粒pTWIN1上,并转化至大肠杆菌ER2566,IPTG诱导表达CBD-intein1-EgAgB8/3融合蛋白后进行纯化,用SDS-PAGE电泳和western blot分析鉴定融合蛋白与目的蛋白rEgAgB8/3的表达量和纯度。结果成功克隆获得EgAgB8/3基因目的片段和具有蛋白自剪切功能的重组表达载体pTWIN1-EgAgB8/3,并鉴定其表达的融合蛋白主要以可溶形式存在;构建的重组载体中融合标签的几丁质结合域(CBD)和内含肽(intein1)分别使亲和层析纯化和融合标签自剪切一步完成。结论成功的构建重组表达载体pTWIN1-EgAgB8/3,获得高表达融合蛋白CBD-intein1-EgAgB8/3,并经简单后续处理即可获得含极少任何额外氨基酸的可溶性目的蛋白rEgAgB8/3,尽可能保证了其原有的结构和活性,为抗rEgAgB8/3特异性单克隆抗体的快速制备奠定了基础。

细胞凋亡检测蛋白AnnexinV的制备纯化和初步评价

文章利用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达了人重组AnnexinV,建立了批量获得AnnexinV工程菌诱导表达的最佳温度、时间和包涵体的操作程序。通过SDS PAGE分析和得到的AnnexinV标记上FITC后能对地塞米松引起Balb/c小鼠胸腺单细胞产生的凋亡进行有效检测的实验表明:经过离子层析纯化后得到了高纯度、有生物活性的人重组AnnexinV纯品。细胞结合分析的结果显示:AnnexinV的KD值为8.53nmol/L,RT为8.79nmol/L。

黄斑蓝子鱼Δ6Δ5 Fads2蛋白重组表达和多克隆抗体的制备

黄斑蓝子鱼(Siganus canaliculatus)是首个被发现具有长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)合成能力的海水鱼类,而脂肪酸去饱和酶(Fads2)是内源性合成LC-PUFA的关键限速酶.为深入研究鱼类Δ6Δ5 Fads2的生物学功能及其表达调控机制,本研究选取黄斑蓝子鱼Δ6Δ5 fads2基因的编码区序列长255 bp,通过限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切,将其插入质粒pGEX-6p-1,获得Δ6Δ5 fads2基因的重组表达载体,经IPTG诱导表达获得大量重组表达蛋白.以纯化后的Δ6Δ5 Fads2重组蛋白为抗原注射免疫KM小鼠后提取血清,并进行Western blot鉴定产生多克隆抗体的特异性.结果表明,本研究成功构建了pGEX-6p-1-Δ6Δ5 Fads2原核表达载体,表达纯化后获得大小约35.4 ku的Δ6Δ5 Fads2重组表达蛋白,利用KM小鼠得到的多克隆抗体特异性好,其效价约为1∶3.2×104.该抗体可为深入研究鱼类Δ6Δ5 Fads2的生物学功能及其表达调控机制提供基础条件,从而有助于研发提高鱼体内源性LC-PUFA合成能力的方法,降低养殖鱼类饲料中鱼油添加比例,促进养殖业的健康发展.

玉米大斑病菌细胞周期蛋白依赖性激酶结构亚基StCks1鉴定及其基因功能分析

【目的】Cks1(cyclin-dependent kinase subunit 1)是细胞周期蛋白依赖性激酶复合体CDK(cyclin-dependent kinase)的结构亚基,是细胞周期调控过程中的关键基因。论文旨在鉴定玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)StCks1,分析玉米大斑病菌附着胞发育过程中StCks1表达量差异及其互作蛋白,为进一步研究StCks1在附着胞发育中的作用打下基础。【方法】通过对玉米大斑病菌野生型菌株01-23全基因组数据分析,获取StCks1蛋白序列;利用软件MEGA 5.0和在线数据库Pfam、SMART对酿酒酵母、裂殖酵母和拟南芥等物种Cks1蛋白进行系统发育树构建和保守结构域分析;收集玉米大斑病菌附着胞发育不同时期样品进行转录组测序以及表达量分析。利用原核诱导表达系统,构建原核表达载体pGEX-6p-3-StCks1,并转化大肠杆菌表达菌株BL21,对重组蛋白GST-StCks1诱导表达纯化;通过GST pull-down、Western blot技术和酵母双杂交试验,鉴定StCks1的互作蛋白。【结果】玉米大斑病菌全基因组中鉴定到唯一StCks1蛋白编码基因,该蛋白由130个氨基酸组成;其三级结构主要由4股β折叠和3个α螺旋构成,含有HxPEPH(His-anyPro-Glu-Pro-His)保守位点和Cks保守结构域;通过转录组测序和表达量分析发现,StCks1在附着胞发育不同时期表达量显著上调;重组蛋白GST-StCks1在1 mmol·L^(-1) IPTG,30℃诱导2 h可获得大量可溶性蛋白;通过GST pull-down技术获取大量互作蛋白并进行质谱鉴定,通过Western blot和酵母双杂交试验,验证StCks1与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1存在互作。【结论】玉米大斑病菌中含有唯一的StCks1,通过与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1互作调控附着胞的发育。