神经突起因子酵母双杂交诱饵质粒构建和转化

目的构建和转化神经突起因子(Neuritin)的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究Neuritin的功能及作用机制奠定基础。方法用PCR扩增neuritin全长cDNA中编码开放读框的基因片段;将该基因片段与pLex-A载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;将核苷酸序列正确的重组质粒转化入EGY48[p8op-LacZ]酵母菌株。结果成功构建pLexA-neuritin重组质粒。转化有重组质粒和pLexA空载体的2种EGY48[p8op-LacZ]酵母都能在SD/Gal/Raf/-His/-Ura培养基中长成白色菌落,同时,转化pLexA-pos阳性对照质粒的酵母菌在相同条件下长成蓝色菌落,但都不能在SD/-His/-Leu/-Ura培养基中生长,在SD/-His/-Ura液中培养16 h后,A600均值均为0.9。表明重组质粒表达的融合蛋白没有激活LEU2和lacZ酵母报告基因表达的活性,也没有酵母毒性作用。结论构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的人胎脑cDNA文库筛选。

人端粒酶RNA突变体酵母三杂交诱饵质粒的构建

目的对人端粒酶RNA进行多位点的突变并构建该突变体的酵母三杂交诱饵质粒,且进行毒性检测。方法根据人端粒酶RNA(hTR)序列及突变位点设计引物,运用重叠延伸PCR法对hTR基因的第41位、第80位及第102位碱基进行T→A突变,将突变后的片段克隆入PMD18T载体,经测序正确后再亚克隆到酵母三杂交诱饵质粒PRH3'中,PCR及酶切鉴定。鉴定成功的重组诱饵质粒转化到酵母细胞L40ura3/pHyblex/ZeoMS2进行毒性检测。结果经过测序验证,该基因预期位点突变成功且其他序列未发生随机突变,重组诱饵质粒构建成功,转化酵母菌之后对宿主无毒性。结论成功构建了hTR突变体的重组质粒PRH3'-hTRm,可作为酵母三杂交系统中的"诱饵"。

柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4酵母双杂交诱饵质粒的构建与检测

为了筛选出柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶(Et CDPK4)在虫体内发挥作用时的作用受体即相互作用蛋白,构建了能够应用于筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交c DNA文库的诱饵重组质粒p GBKT7-Et CDPK4,本研究以柔嫩艾美耳球虫子孢子为材料,提取了总RNA,经反转录得到c DNA第一链,利用PCR的方法扩增获得了该基因大小为1660 bp的Et CDPK4的功能区片段,并将其连接于酵母BD诱饵p GBKT7载体上,经双酶切鉴定和序列分析,以及检测了p GBKT7-Et CDPK4在酵母双杂交系统中的自激活、细胞毒性和表达情况。结果显示,成功构建了酵母双杂交诱饵重组质粒p GBKT7-Et CDPK4,在酵母双杂交系统中没有自激活活性和细胞毒性,且在酵母细胞Y2HGold中能够进行表达。表明所构建的诱饵质粒p GBKT7-Et CDPK4可以应用于酵母双杂交系统中,用于筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交c DNA文库,获得可能与Et CDPK4具有相互作用的蛋白质。

SIGIRR胞内区酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活作用检测

目的：构建单免疫球蛋白白细胞介素-1受体相关蛋白（SIGIRR）胞内区酵母双杂交诱饵质粒，并检测其是否存在自激活作用。方法聚合酶链反应（PCR）扩增人SIGIRR胞内区基因片段（480～1230 bp），并将此基因片段重组入pSos载体中，构建诱饵质粒pSos-SIGIRR ，经酶切及测序鉴定构建正确后，将重组质粒与对照质粒共转化感受态酵母菌cdc25H ，接种于25℃SD/Glucose（-UL）和SD/Galactose（-UL）平板以及37℃ SD/Glucose（-UL）和SD/Galactose（-UL）平板上，连续观察6 d酵母菌生长状况；用Western blot法检测目的蛋白表达情况。结果正确构建了人SIGIRR胞内区酵母双杂交诱饵质粒pSos-SIGIRR ， pSos-SIGIRR在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用。Western blot结果显示，目的蛋白以170＆#215;103的融合蛋白形式表达。结论诱饵质粒pSos-SIGIRR可应用于酵母双杂交系统中，为在人肺互补脱氧核糖核酸（cDNA ）文库中寻找与SIGIRR相互作用蛋白奠定了重要基础。

蓝舌病病毒衣壳蛋白VP2、VP5、VP7酵母双杂交诱饵质粒的构建及鉴定

蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的结构主要由3层衣壳蛋白组成,其中VP2、VP5蛋白构成了BTV的外层衣壳,VP7蛋白构成了BTV的中间衣壳,最内层衣壳则由VP3蛋白构成。VP2、VP5及VP7蛋白在BTV侵染宿主细胞的过程中起着非常重要的作用。为了研究BTV与宿主细胞相互作用的分子机制,本研究将BTV的VP2、VP5、VP7基因分别克隆到pGBKT7载体中,成功构建了pGBKT7-VP2、pGBKT7-VP5与pGBKT7-VP7 3个诱饵质粒,且通过自激活和毒性验证,证明所构建的3个质粒均无自激活作用,对酵母细胞无毒性作用。本研究为今后利用酵母双杂交筛选VP2、VP5、VP7蛋白中与宿主细胞相互作用的蛋白做好了铺垫,为深入研究BTV与宿主细胞的相互作用奠定了基础。

硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ诱饵质粒的构建和检测

目的构建硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ(PrxⅡ)诱饵质粒,同时检测其在酵母菌内的表达和对酵母细胞的毒性。方法提取人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞的RNA,利用RT-PCR获得其cDNA,PCR方法扩增PrxⅡ基因片段,纯化后以内切酶双酶切PrxⅡ和酵母表达载体pGBKT7,回收产物并连接,重组质粒命名为pGBKT7-PrxⅡ,将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用。结果构建的诱饵载体pGBKT7-PrxⅡ测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确。将pGBKT7-PrxⅡ成功转化入酵母感受态AH109,并证明PrxⅡ蛋白对酵母无毒性作用。结论证实了PrxⅡ蛋白无酵母毒性,诱饵质粒pGBKT7-PrxⅡ可以用于酵母双杂交研究前列腺癌发病机制。

新城疫病毒V蛋白C端酵母双杂交诱饵质粒的构建与鉴定

为构建新城疫病毒(NDV)V蛋白C端酵母双杂交诱饵质粒,用RNA试剂盒提取NDV F48E9株的RNA,通过反转录试剂盒将抽提的RNA反转录,以反转录合成的c DNA为模板,通过PCR扩增,获得V蛋白C端基因(VCTD)。通过酶切连接的方法将V蛋白C端基因克隆至p GBKT7载体上,命名为p GBKT7-VCTD。将p GBKT7-VCTD转化酵母Y2H Gold酵母感受态细胞,转化产物涂布营养缺陷型平板,观察平板上菌落生长情况,判定诱饵质粒有无自激活能力;同时挑取平板上的生长的菌落接种液体培养基培养,绘制生长曲线,判定p GBKT7-VCTD诱饵质粒有无毒性。酶切和测序结果表明,成功构建p GBKT7-VCTD诱饵质粒,且该诱饵质粒在酵母细胞中无毒性和自激活能力。本研究成功构建了p GBKT7-VCTD诱饵质粒,为筛选NDV V蛋白C端纳米抗体奠定基础。

香蕉条斑病毒ORF Ⅰ、ORF Ⅱ酵母双杂交系统诱饵质粒的构建及鉴定

以连接在pMD-18T载体上的香蕉条斑病毒(BSV)全基因组为模板,PCR扩增得到了带有Gateway R重组反应接头序列的香蕉条斑病毒ORFⅠ及ORFⅡ基因片段,经过BP、LR重组后,构建成带有目的片段的酵母双杂诱饵质粒pDEST32-O1及pDEST32-O2。将质粒转化E.coli DH5α感受态细胞,筛选序列和编码框均正确的重组质粒。将以上2种正确的重组质粒分别与用于构建诱饵质粒的pDEST22空质粒共转化酵母MaV203感受态细胞,利用营养缺陷培养基(SC-Leu-Trp)筛选转化子,并对转化子进行毒性鉴定、自激活鉴定以及3-AT抑制浓度鉴定。结果显示,2种转化子均生长正常,说明所构建的2个重组质粒表达蛋白对酵母无毒性作用,其在特异营养缺陷培养基(SC-Leu-Trp-Ura)中无法生长,不能产生自激活现象,3-AT抑制浓度分别为50、75 mmol/L。以上结果说明所构建的2种诱饵质粒均可用于后续酵母双杂工作,为BSV与宿主的蛋白互作奠定了基础。

人程序性死亡受体配体1免疫球蛋白可变区结构域基因酵母双杂交诱饵质粒的构建及其自激活检测

目的 构建人程序性死亡受体配体1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)免疫球蛋白可变区(immunoglobulin variable region,IgV)结构域基因酵母双杂交重组诱饵质粒,检测其在酵母中的表达情况,检测PD-L1 IgV蛋白细胞毒性和自我激活,以及PD-L1 IgV与人硫氧还蛋白(human thioredoxin,hTrx)之间的相互作用情况。方法 利用生物信息学方法对人PD-L1进行分析,并根据NCBI GenBank数据库中登录的PD-L1基因编码区序列设计扩增PD-L1 IgV结构域的引物,以pENTER-PD-L1质粒为模板进行PCR扩增,克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7。将鉴定正确的重组诱饵质粒及pGBKT7空载体分别转化至Y2HGold酵母细胞,PCR及Western blot法检测PD-L1 IgV基因及蛋白的表达;同时检测PD-L1 IgV蛋白毒性及自我激活效应,并采用滴板法检测诱饵蛋白PD-L1 IgV与hTrx相互作用情况。结果 PD-L1的生物信息学分析结果与相关报道一致;成功构建了重组诱饵质粒pGBKT7-PD-L1 IgV,并获得Y2HGold阳性克隆子,PD-L1 IgV能在其中稳定表达。空载体pGBKT7、重组诱饵质粒pGBKT7-PD-L1 IgV在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal平板上生长良好,菌落大小、数量一致,呈白色,在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA平板上两者均不生长,表明PD-L1 IgV蛋白对酵母无毒性且无自我激活效应;滴板法试验结果显示,所有实验组在SD/-Trp/-Leu平板上生长良好,仅阳性对照组可在SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板上生长且呈蓝色,表明诱饵蛋白PD-L1 IgV、hTrx不存在自我激活现象,且两者之间也不存在相互作用。结论 成功构建了重组人PD-L1 IgV酵母双杂交诱饵质粒,PD-L1 IgV蛋白对酵母细胞无毒性且无自我激活效应,且与hTrx之间无相互作用。后续可利用hTrx构建肽适体文库,从中筛选可与PD-L1 IgV特异结合的肽适体。

放线杆菌外膜蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活与毒性检测

为了筛选胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白在肺泡上皮细胞上的作用受体,应用酵母双杂交技术构建诱饵质粒载体pGBKT7-omp(胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白),从胸膜肺炎放线杆菌提取基因组DNA,用PCR方法获得omp,克隆于pGBKT7载体上,进行酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-omp在酵母双杂交系统中的自激活和毒性作用。结果表明,成功构建了诱饵质粒载体pGBKT7-omp,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用。表明pGBKT7-omp可应用在酵母双杂交系统中,用于寻找猪肺泡上皮细胞cDNA文库中与omp相互作用的蛋白质。

弗氏志贺菌侵袭性基因ipaC诱饵质粒的构建及其自激活作用

目的构建弗氏志贺菌侵袭性基因ipaC诱饵质粒,并检测其自激活作用。方法 PCR法扩增弗氏志贺菌侵袭素ipaC基因,克隆入诱饵载体pSos,构建诱饵质粒pSos-IpaC,转化酵母菌cdc25H,进行Western blot分析,并检测诱饵质粒的自激活特性。结果酵母双杂交诱饵质粒pSos-IpaC经酶切及测序证明构建正确;Western blot分析显示,诱饵质粒表达了相对分子质量约214000的融合蛋白;诱饵质粒对酵母菌cdc25H无自激活作用,且该质粒表达的融合蛋白在宿主细胞质中定位正确。结论已成功构建了诱饵质粒pSos-IpaC,该质粒对酵母菌cdc25H无自激活作用。

AMP激活的蛋白激酶α2大肠杆菌双杂交诱饵重组质粒的构建及鉴定

目的构建大肠杆菌双杂交系统的诱饵重组质粒。方法PCR扩增大鼠AMP激活的蛋白激酶α2(AMP-ac-tivated prote in k inaseα2,AMPKα2)蛋白编码区cDNA,与大肠杆菌双杂交表达载体pBT构建融合蛋白表达质粒pBT-AMPKα2。经酶切和测序鉴定后,将pBT-AMPKα2转化XL-1 B lue MRF’大肠杆菌报告菌株,检测诱饵融合蛋白的表达。并用pBT-AMPKα2和pTRG空载体共转化XL-1 B lue MRF’菌株,通过3-氨基-1,2,4-三唑(3-am ino-1,2,4-triazole,3-AT)选择性筛选平板检测诱饵融合蛋白的自激活作用。结果酶切和测序结果表明AMPKα2蛋白编码序列成功克隆入pBT载体,融合区阅读框正确。诱饵重组质粒pBT-AMPKα2能表达λcI/AMPKα2融合蛋白。转化有pBT-AMPKα2和pTRG空载体的XL-1 B lue MRF’大肠杆菌报告菌株在3-AT选择性筛选平板上不生长,而在no 3-AT非选择性筛选平板上生长良好,表明pBT-AMPKα2重组质粒能在大肠杆菌细胞中正确表达且无自激活作用。结论构建的pBT-AMPKα2诱饵重组质粒可用于下一阶段的cDNA文库筛选。

髓样分化因子88酵母双杂交诱饵质粒构建及鉴定

髓样分化因子88（MyD88）是Toll样受体信号通路中的一个关键接头分子。我们构建MyD88蛋白酵母双杂交诱饵质粒，用于筛查与其相互作用的蛋白。一、材料与方法1．分子克隆：通过反转录一聚合酶链反应（RT-PCR）获得MyD88片段，PCR产物及pGBKT7质粒分别采用NdeI和EcoRI进行双酶切并纯化后，16℃连接过夜后转化大肠杆菌，进行双酶切和测序鉴定。

人GINS2基因酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活检测

目的构建人GINS2基因酵母双杂交诱饵质粒,并进行自激活检测。方法根据GenBank中登录的GINS2基因编码区序列(NM016095)设计引物,以pCDNA3.1-GINS2质粒为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至诱饵载体pGBKT7上,构建诱饵质粒pGBKT7-GINS2。将鉴定正确的诱饵质粒及对照质粒共同转化至酵母细胞AH109中培养,Western blot法检测诱饵蛋白GINS2的表达,随机挑取6个菌落,进行His3、Ade2及LacZ报告基因的自激活效应检测。结果经双酶切及测序鉴定证明诱饵质粒pGBKT7-GINS2构建正确。诱饵蛋白GINS2相对分子质量为21000,可在AH109酵母细胞中稳定表达。诱饵质粒转化的酵母细胞在SD/-Trp/-Leu缺陷平板生长,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷平板上不生长,表明报告基因His、Ade2未被激活,报告基因LacZ检测结果与阴性对照相同,表明诱饵蛋白GINS2不存在自激活。结论成功构建了人GINS2基因酵母双杂交诱饵质粒,其表达蛋白对酵母AH109细胞无毒性,也无自激活现象,可用于后续蛋白筛选试验。

协同激活分子CBP诱饵表达质粒的构建和鉴定

构建协同激活分子CBP(CREB(cAMP response element binding)binding protein)的诱饵表达质粒pGBKT7-CBP并检测其蛋白表达、毒性和自激活作用.PCR扩增小鼠CBP的基因编码序列(CDS(coding sequence)序列)并克隆入诱饵表达载体pGBKT7中,通过酶切和测序鉴定后,把构建好的诱饵表达质粒pGBKT7-CBP转化到酵母AH109细胞中,Western blot检测诱饵蛋白表达情况,同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果成功扩增了小鼠CBP基因的CDS序列,并成功克隆到酵母诱饵表达载体pGBKT7中,测序结果正确.诱饵表达质粒成功转化到酵母AH109细胞中,Western blot分析结果证实酵母细胞高表达诱饵蛋白CBP,但诱饵蛋白有自激活作用.提示pGBKT7-CBP不能用于酵母双杂交或三杂交系统检测CBP与其他蛋白质或小分子的相互作用,对其他研究CBP生物学功能试验的方法选取具有一定的借鉴意义.

羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及其毒性和自激活效应检测

[目的]构建含羊布鲁氏菌16M Omp25基因的酵母双杂交诱饵质粒,检测诱饵质粒表达产物对cdc25H酵母细胞有无毒性作用以及对报告基因有无激活作用。[方法]聚合酶链反应(PCR)扩增布鲁氏菌Omp25基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos上,构建诱饵重组质粒pSos-Omp25,经测序正确后,将其将转化到酵母菌cdc25H感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。[结果]序列测定证明重组诱饵质粒pSos-Omp25构建成功;重组质粒表达产物对cdc25H酵母细胞无毒性,对报告基因无激活作用。[结论]利用SOS恢复系统(SRS)成功构建了羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白酵母双杂交诱饵质粒,为筛选与羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白相互作用的蛋白创造了条件。

神经特异性转录因子DAT1酵母双杂交诱饵载体的构建

目的:用神经特异性转录因子DAT1构建酵母双杂交系统中的诱饵载体。方法:根据GenBank中提供的DAT1序列设计引物,以小鼠脑组织cDNA文库为模板,PCR扩增DAT1,并与pLexA载体连接,测序鉴定。用醋酸锂法转化酵母菌EGY48,在选择性培养基上观察pLexA-DAT1在EGY48中的表达。结果:PCR扩增出的DNA片段约490bp,大小正确,构建的融合表达载体pLexA-DAT1,测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确。转化了pLexA-DAT1的酵母菌EGY48在加有X-Gal的SD/Gal/Raf/-His/-Ura营养缺陷型诱导平板上菌落不变蓝,证明LexA-DAT1融合蛋白本身不具有激活p8op-LacZ报告基因的能力,可以用作进一步的实验。结论:获得了在酵母细胞中正确表达且未自主激活报告基因的融合表达载体pLexA-DAT1,可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”。

HBV PreS1蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及其毒性和自激活效应检测

目的利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵质粒,并检测其表达产物对cdc25酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。方法聚合酶链反应(PCR)扩增HBV PreS1基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵重组质粒pSos-PreS1,经测序正确后其将转化酵母菌cdc25感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无自激活作用。结果序列测定证实重组诱饵质粒pSos-PreS1构建成功。重组质粒转化入酵母细胞后,经检测其表达产物对cdc25酵母细胞无毒性作用,对报告基因亦无自激活作用。结论可以利用SRS来研究与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步研究乙型肝炎病毒的致病机制奠定了基础。

NT3的酵母双杂交诱饵载体的构建和初步鉴定

构建和转化神经营养素3(neurotrophin 3,NT3)的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究NT3的功能及作用机制奠定基础。用PCR扩增NT3基因cDNA中编码完整开放读框的基因片段;将该基因片段与pLexA载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;将核苷酸序列正确的重组质粒转化入EGY48[p8op LacZ]酵母菌株。结果成功构建pLexA NT3重组质粒。转化有重组质粒和pLexA空载体的二种EGY48[p8op LacZ]酵母都能在SD Gal Raf His Ura培养基中长成白色菌落(同时,转化pLexA pos阳性对照质粒的酵母菌在相同条件下长成蓝色菌落),但都不能在SD His Leu Ura培养基中生长,在SD His Ura液中培养16h后,OD600均值均为0.8±0.1。这表明,重组质粒表达的融合蛋白没有激活LEU2和lacZ酵母报告基因表达的活性,也没有酵母毒性作用。因此,构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的人胎脑cDNA文库筛选。

糖皮质激素受体配体结合区的克隆及酵母双杂交诱饵载体的构建和表达

目的 用糖皮质激素受体配体结合区 (GR LBD)片段构建酵母双杂合系统中的诱饵载体。方法 根据GenBankGR LBD序列设计引物 ,以人胎肝cDNA文库为模板 ,PCR扩增GR LBD片段 ,该片段与pGEM TVectorSystems连接 ,SmaⅠ SalⅠ双酶切鉴定。回收相应连接片段 ,与酵母表达载体pGBKT7连接 ,重组质粒命名为pGBKT7 GRLBD ,送大连宝生物公司测序。用醋酸锂法转化酶母菌AH10 9,在选择性培养基上观察pGBKT7 GRLBD在AH10 9中的表达情况 ,酵母双杂交检测GR与已知阳性蛋白SRC 1的结合 ,鉴定转化酵母株表型及表达。结果 PCR扩增出的DNA片段约 893bp ,大小正确 ,并成功连接到T 载体 ,释放出所需片段893bp。构建与Gal4 BD融合表达载体pGBKT7 GRLBD ,测序结果表明序列完全正确 ,融合区域的读码框正确。pGBKT7 GRLBD转化感受态AH10 9,在SD Trp板上生长良好 ,AH10 9[pGBKT7 GRLBD]与Y187[pTD1 1]杂交后在SD Trp、 Leu、 Trp Leu板上生长而不能在 His Leu Trp、 Ade His Leu Trp板上生长 ,说明AH10 9[pGBKT7 GRLBD]转化成功但并未自主激活报告基因 ,酵母双杂交测定GRLBD与SRC 1有结合作用。结论 获得了在酵母细胞中正确表达且未自主激活报告基因的融合表达载体pGBKT7-GRLBD ,可作为酵母双杂合系统中的“诱饵”。