STAT5诱骗核苷酸对K562细胞中bcl-x启动子转录激活的调控

背景与目的:信号转导和转录活化因子5(signaltransducersandactivatorsoftranscription5,STAT5)组成性激活在慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)细胞恶性转化中起重要作用。本文研究STAT5诱骗核苷酸(decoyoligonucleotides,decoyODNs)对STAT5下游靶基因bcl鄄x转录激活的调控作用。方法:设计并合成decoyODNs、错配核苷酸(M鄄ODNs)和FAM标记decoyODNs。FAM鄄decoyODNs作为对照,在脂质体介导下转染白血病细胞K562,流式细胞仪(FCM)和倒置荧光显微镜检测FAM鄄decoyODNs的摄入情况。构建人bcl鄄x启动子的荧光素酶报告质粒pGL3b鄄bclxP,将其与decoyODNs或M鄄ODNs共转染K562细胞,检测转染后K562细胞中荧光素酶的表达。K562细胞分别转染decoyODNs和M鄄ODNs后,用RT鄄PCR检测bcl鄄xL表达,FCM检测细胞凋亡。结果:FAM鄄decoyODNs在终浓度0.04～4μmol/L范围内的摄入量呈剂量依赖性。24h时FAM鄄decoyODNs4μmol/L处理组转染效率高达99.1%,并在倒置荧光显微镜下也观察到细胞内有绿色荧光物质。decoyODNs处理组荧光素酶活性降低[(181.48±204.46)RLU/μgprotein],与对照组[(675.26±62.91)RLU/μgprotein]相比有显著性差异(P<0.05);而M鄄ODNs处理组细胞荧光素酶的活性[(632.07±98.95)RLU/μgprotein]与对照?

体外STAT5诱骗寡核苷酸技术的实验研究

目的优化信号转导和转录活化因子5(signal transducers and activators of transcription,STAT5)诱骗寡核苷酸(decoyoli-godeoxynucleotide,decoyODNs)技术的实验条件,为阻断K562细胞STAT5信号转导途径,进而诱导细胞表型转变奠定基础。方法设计并合成STAT5decoyODNs、FAM荧光标记的decoyODNs和decoyODNs突变型(M-decoyODNs);SDS-PAGE检测不同退火缓冲液条件下decoyODNs双链形成率;倒置荧光显微镜下通过阳性细胞计数比较DEAE、lipofectin和DMRIE-C3种转染试剂对decoyODNs的转染效率;流式细胞仪(FCM)检测转染12、24和72h时FAM-decoyODNs摄取率和荧光强度,检测decoyODNs的稳定性;MTT实验检测decoyODNs对K562细胞活力的影响;RT-PCR检测decoyODNs对pim-1和c-myc基因表达的影响。结果退火缓冲液(10mmol/LTris,pH8.0,50mmol/LNaCl,1mmol/LEDTA)更有利于decoyODNs双链形成。DMRIE-C的转染效率(99.2±4.6)%高于DEAE和lipofectin(67.15±7.3)%、(83.2±3.8)%,P<0.05,并且DMRIE-C介导decoyODNs转染12、24、72h的转染效率均>98%。MTT实验发现DMRIE-C的细胞毒性低,细胞活性为94.23%,decoyODNs处理组能显著抑制K562细胞MTT还原能力,与其余组相比具有显著性差异(P<0.05);RT-PCR结果发现decoyODNs处理组pim-1基因下降了71.20%,c-myc下降了59.46%,与其余组相比有统计学意义(P<0.05)。结论建立了decoyODNs最佳的双链形成条件;DMRIE-C能显著增强decoyODNs转染K562细胞的效率;decoyODNs能抑制K562细胞活力,抑制STAT5靶基因的转录。

早期生长反应因子-1诱骗寡脱氧核苷酸对大鼠球囊损伤后细胞黏附分子-1的影响

目的观察局部转染早期生长反应因子-1(early growth response factor-1,Egr-1)的诱骗性寡脱氧核苷酸(decoy oligodeoxynucleotides,decoy ODNs)对球囊损伤颈总动脉后内膜增生及细胞内细胞黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表达的影响,并初步探讨Egr-1 decoy ODNs抑制球囊损伤后内膜增生的机制。方法 96只健康雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、单纯损伤组、杂码寡脱氧核苷酸(scrambled decoy ODNs,SCR)组和Egr-1 decoy ODNs组,每组24只。术后3、7、14及21 d处死动物,每组6只。应用HE染色、Real time RT-PCR和Western-blotting方法观察大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生情况、Egr-1和ICAM-1的表达及Egr-1 decoy ODNs对它们的影响。结果①内皮损伤后3 d内膜增厚不明显,7d内膜开始增厚,14 d和21 d时内膜明显增厚。②Egr-1mRNA和蛋白水平于术后3 d开始升高,21 d时达到顶峰,而ICAM-1的mRNA和蛋白水平均于术后3 d开始升高,7 d达高峰,14 d时下降。③转染Egr-1 decoyODNs治疗后,在各个时间点内膜增厚程度减轻,Egr-1和ICAM-1表达减少,与假手术组比较差异有统计学意义P<0.01)。结论 Egr-1 decoy ODNs可能是通过特异性抑制Egr-1的表达,进而抑制ICAM-1的表达,从而减轻血管损伤后内膜增生。

生长因子-1诱骗寡核苷酸对大鼠颈总动脉球囊损伤后血小板源性生长因子-BB表达的影响

目的探讨针对早期生长反应因子-1(Egr-1)的诱骗性寡脱氧核苷酸(decoy ODN)对大鼠动脉损伤后内膜增生的影响和可能的机制。方法制备大鼠颈动脉球囊损伤模型,将96只Wistar大鼠随机分为假手术组、单纯损伤组、杂码寡脱氧核苷酸(SCR)组和治疗组,每组24只。术后3、7、14、21 d处死动物,每组6只。应用HE染色、Real time RT-PCR和Western blot方法观察大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生情况、Egr-1和血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)的表达及Egr-1 decoy ODN对它们的影响。结果①内皮损伤后3 d内膜增厚不明显,7 d内膜开始增厚,14、21 d时内膜明显增厚。②Egr-1 mRNA和蛋白水平于术后3 d开始升高,21 d时达到顶峰,而PDGF-BB的mRNA和蛋白水平均于3 d开始升高,14 d时达到顶峰。③转染Egr-1 decoy ODN治疗后,在各个时间点内膜增厚程度减轻,与对照组比较,Egr-1和PDGF-BB表达明显减少,差异有高度统计学意义(P<0.01)。结论 Egr-1 decoy ODN可能是通过特异性抑制Egr-1的表达,进而抑制PDGF-BB的表达,达到减轻新生内膜厚度、从而减轻血管损伤后内膜增生的目的。

诱骗寡聚脱氧核苷酸在疾病治疗中的研究进展

诱骗寡聚脱氧核苷酸(decoy oligodeoxynucleotide,decoy ODN)通过与目的基因启动子上的转录因子结合位点(trascription factor binding site,TFBS)竞争性地结合转录因子,从而影响转录因子调控的靶基因表达。近年来,越来越多的研究者证实通过识别各种疾病相关的信号通路与转录因子,设计相应的decoy ODN,可以对一些疾病起到治疗效果,这其中包括运用STAT3 decoy ODN治疗恶性肿瘤和运用NF-κB decoy ODN治疗炎症纤维化疾病和心血管疾病。本文将总结分析近5年decoy ODN策略在疾病研究中的运用,为治疗肿瘤、纤维化、心脑血管病等疾病提供新的思路。

诱骗寡聚核苷酸技术在纤维化疾病中的运用及其递送策略的选择

纤维化(fibrosis)是由多种病因所致的纤维结缔组织增多,实质细胞减少为特征的器官结构破坏和功能减退的病理变化,可发生于多种器官.近年来,包括反义寡核苷酸、RNA干扰、诱骗寡聚核苷酸(Decoy oligodeoxynucleotide,Decoy ODN)技术等多种分子生物学技术应用于纤维化疾病的基础研究和临床防治,其中,Decoy ODN技术通过诱骗策略,能够快速靶向性阻断特异性转录因子与其靶基因启动子的结合,从而干扰其表达,具有干预纤维化基因表达的潜能,在纤维化疾病的基础研究和临床应用方面得到了快速发展.本文将对Decoy ODN技术应用于纤维化疾病及其形态结构和在体内的投递策略作一评述.

Egr-1的诱骗性寡脱氧核苷酸抑制大鼠颈总动脉损伤后MMP-2的表达

目的观察局部转染早期生长反应因子-1(early growth response factor-1,Egr-1)的特异诱骗寡脱氧核苷酸(decoy oligodeoxynucleotides,decoy ODNs)对球囊损伤颈总动脉后基质金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表达的影响及内膜增生的情况,初步探讨Egr-1,decoy ODNs抑制球囊损伤后内膜增生的机制。方法 96只健康雄性Wistar大鼠,随机分为4组,分别为假手术组、对照组、杂码组和诱骗组,每组24只。除假手术组外均应用2F球囊导管行颈总动脉球囊损伤术,术中采用转染试剂FuGENE6介导的Egr-1decoy ODNs转染至损伤后大鼠血管中,与假手术组、对照组、杂码组相比较。术后3、7、14、21d每组处死6只动物。应用HE染色和免疫组织化学方法观察大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生情况和MMP-2蛋白的表达及转染Egr-1decoy ODNs后对它们的影响。结果 (1)、内膜损伤后3d内膜增厚不明显,7d内膜开始增厚,14、21d时内膜明显增厚。(2)、在假手术组近腔面中膜可见MMP-2有少量散在阳性表达;在对照组及杂码组动脉损伤后3d,在近腔面中膜,有少量阳性表达,与假手术组相比,阳性表达指数上升。7d时在新生内膜和靠近新生内膜处中膜表达明显,14d后表达逐渐下降。(3)转染decoy ODNs治疗后,在各个时间点内膜增厚程度减轻,MMP-2蛋白表达减少,与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。结论血管球囊损伤后,内膜7d开始增生,14d、21d增生更明显,而MMP-2在7d时表达明显,之后逐渐下降,Egr-1decoy ODNs能抑制MMP-2的表达,从而减轻血管损伤后内膜的增生。

Egr-1的诱骗性脱氧核苷酸对大鼠颈总动脉损伤后内膜增生的影响

目的:针对大鼠Egr-1的诱骗性寡脱氧核苷酸(decoy ODN),作用于损伤后的动脉内膜,观察其对血管损伤后新生内膜增生的影响。方法:行HE染色观察血管内膜、中膜的厚度改变,并分组进行计算机图象分析,计算出内膜/中膜(I/M)的面积比。结果:治疗组与同一时间点对照治疗组和对照组相比,内膜增生受到抑制,两者之间差异有显著性(P<0.01)。结论:decoy ODN通过诱骗转录因子与它结合,下调转录因子所调控的基因表达,减轻了大鼠动脉损伤后新生内膜的增生程度。

Egr-1诱骗性寡脱氧核苷酸对大鼠动脉损伤后bFGF表达的影响

目的观察Egr-1诱骗性寡脱氧核苷酸(decoy ODN)对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响。方法RT-PCR法测定血管壁组织的bFGF表达,采用Western-blot方法测定血管组织bFGF蛋白含量,以观察Egr-1诱骗性脱氧核苷酸对大鼠颈总动脉损伤后bFGF表达的影响。结果decoy ODN作用后,bFGFmRNA各时间点蛋白条带灰度减弱,bFGFmRNA表达减少。结论decoyODN可能是通过特异性抑制bFGF的表达,达到减轻新生内膜厚度,预防再狭窄的目的。

Egr-1的诱骗性脱氧核苷酸对大鼠动脉损伤后NO、NOS、ET水平的影响

目的:探讨早期生长反应因子-1(Egr-1)的诱骗性脱氧核苷酸(EODN)对实验性大鼠动脉损伤后血管内皮功能的影响。方法:Wistar大白鼠96只,随机分为假手术组、对照组1、对照组2和基因治疗组(各24只)。行左颈总动脉内膜剥脱术后,治疗组经带孔球囊导管末端将含有FITC标记的EODN 500 μg,转染试剂FuGENE6 30μl的1mmol/L MgCl2液200 μl局部加压注入至损伤的血管节段内,使其在局部作用15min;对照组1局部注入200 μl的1mmol/L MgCl2液;对照组2局部注入含30 μl FuGENE6 Reagent的1mmol/L MgCl2液200 μl。分别于3,7,14,21d每组各处死动物6只,处死前心脏取血检测一氧化氮、一氧化氮合酶、内皮素浓度。结果:与两对照组比较,EODN治疗组血清一氧化氮和一氧化氮合酶含量均增高(P<0.05),而血浆内皮素浓度则有所降低(P<0.05)。结论:Egr-1特异脱氧核酶可改善动脉损伤后血管内皮功能。

生长反应因子与大鼠颈动脉损伤后内膜增生

背景:经皮冠状动脉介入治疗后再狭窄仍是影响介入治疗远期疗效的严重的临床问题。目的:在大鼠颈动脉球囊损伤模型中,探讨早期生长反应因子诱骗寡脱氧核苷酸对损伤后的血管内膜的影响,并初步探讨其分子机制。方法:利用2FFogarty导管损伤Wistar大鼠颈动脉,构建大鼠球囊损伤模型,在转染试剂Fugene6介导下经血管腔内转染生长反应因子诱骗寡脱氧核苷酸,苏木精-伊红染色法观察血管内膜增生情况,免疫组化法检测CyclinD1,观察其表达情况。结果与结论:早期生长反应因子诱骗寡脱氧核苷酸可以显著抑制大鼠颈动脉球囊损伤后血管内膜增生,同时也可以下调大鼠颈动脉球囊损伤后表达显著增加的CyclinD1。说明生长反应因子诱骗寡脱氧核苷酸可能通过抑制CyclinD1的表达,使细胞周期停滞,从而抑制损伤后的大鼠颈动脉内膜的增生。