诸氏鲻虾虎鱼胚胎及早期仔鱼发育研究

诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)是我国目前唯一一种已制定质量控制国家标准的海水实验鱼。为探究诸氏鲻虾虎鱼胚胎及早期仔鱼的发育特性,丰富其生物学研究,采用光学显微镜观察诸氏鲻虾虎鱼自繁胚胎、早期仔鱼的发育过程,同时拍照记录其形态变化特征。结果显示,诸氏鲻虾虎鱼产黏性卵,卵呈圆球状,卵径(0.26±0.03)mm,其受精卵吸水膨胀后呈长梭状,长径(0.81±0.05)mm,短径(0.39±0.01)mm。在水温(25.46±0.10)℃条件下,诸氏鲻虾虎鱼胚胎历时73 h 20 min孵出,总积温为1833.33℃·h。胚胎发育历经8个时期。初孵仔鱼全长(1.50±0.01)mm;孵出36 h后仔鱼可开口摄食轮虫;72 h后卵黄囊消失,仔鱼可在水中平游;120 h后仔鱼增长明显,内脏器官发育更加完善。研究结果表明,诸氏鲻虾虎鱼胚胎发育时间短,各发育时期特征明显,仔鱼开口摄食早,生长速度快。该研究可为诸氏鲻虾虎鱼后续研究应用提供基础资料。

诸氏鲻虾虎鱼卵黄蛋白原基因全长cDNA的克隆及表达

为了探讨诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)卵黄蛋白原组织分布及17β-雌二醇(E2)暴露对雄性诸氏鲻虾虎鱼Vg的影响,作者采用RT-PCR、RACE方法克隆并分析了诸氏鲻虾虎鱼卵黄蛋白原(Vg)基因的全长cDNA序列,并对Vg在诸氏鲻虾虎鱼体内的组织表达分布及E2诱导后不同时间表达规律进行了研究。结果表明:获得的Vg cDNA序列全长5 067 bp,开放阅读框(ORF)含4 992 bp,编码1 663个氨基酸,含有信号肽、多丝氨酸区域,推测其编码氨基酸分子量为186.2 ku,等电点为9.31。荧光定量PCR结果显示,Vg在诸氏鲻虾虎鱼肝脏中表达量最高。E2诱导后,诸氏鲻虾虎鱼肝脏中Vg m RNA的表达量第1天达到小高峰,第3天达到高峰,第7天开始明显下降,第11天仍能维持较高水平。本研究成功克隆了诸氏鲻虾虎鱼Vg基因全长cDNA序列,诸氏鲻虾虎鱼肝脏是Vg主要合成场所,E2诱导雄性诸氏鲻虾虎鱼Vg的表达作为生物标志物用于近海环境雌激素类物质的检测具有良好的应用前景。

诸氏鲻虾虎鱼转录组序列中微卫星标记的初步筛选及特征分析

旨在为大规模开发诸氏鲻虾虎鱼微卫星标记,采用高通量测序技术,对诸氏鲻虾虎鱼肝脏转录组进行了测序。结果共获得47 979条Unigenes,利用微卫星查找程序在47 979条Unigenes中共获得6 225个微卫星位点(12.97%),平均每7.02 kb就出现1个微卫星位点。6 225个微卫星位点由226种重复基序组成,主要分布在三、四和五碱基重复类型中。在数量上,单碱基重复类型微卫星位点最多,占42.49%,二碱基和三碱基重复类型所占比例相似,分别为25.22%和26.27%,四、五、六重复类型较少,合计占6.03%。单碱基重复序列中最多的类型为A/T,二碱基重复序列中以AG/CT重复单元为主,三碱基重复序列中以AGC/TCG为优势类型。挑选部分二、三和四单元重复类型微卫星序列,共设计76对引物,可稳定扩增出目的条带的有55对,其中32对具有多态性。结果表明,利用诸氏鲻虾虎鱼转录组数据可快速大量开发微卫星标记。

诸氏鲻虾虎鱼多态性微卫星标记的开发及评价

目的开发诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)多态性微卫星标记,为诸氏鲻虾虎鱼的遗传背景评价提供基础数据。方法采用磁珠富集法,以生物素标记的(AC)15为探针,构建了诸氏鲻虾虎鱼微卫星富集文库。经克隆、筛选、测序后,设计合成微卫星引物,利用野生群体对微卫星引物进行多态性筛选和评价。结果共获得74个含有微卫星重复单元的序列,根据微卫星序列共设计出33对微卫星引物。利用30个野生诸氏鲻虾虎鱼样本对33对引物的微卫星位点进行了评价,其中有12个位点表现出多态性,平均有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及多态信息含量(PIC)分别为2.9167、2.2311、0.4583、0.5633和0.4474。结论所筛选的微卫星标记将为诸氏鲻虾虎鱼遗传质量控制及监测提供实验依据。

诸氏鲻虾虎鱼致病性创伤弧菌的分离与鉴定

从患病的诸氏鲻虾虎鱼分离病原,研究其致病性。通过形态学观察、生理生化特性、HSP60序列扩增及系统发育树分析等方法系统鉴定,并进行了人工感染和毒力基因检测。结果表明,从患病的诸氏鲻虾虎鱼肝脏组织分离到1株革兰阴性杆菌,编号PYMc14-2,回归感染试验证实该菌株为诸氏鲻虾虎鱼的病原菌,毒力基因hemo检测结果阳性。生化特性结果与创伤弧菌类似,PCR扩增获得的486bp的HSP60基因序列与创伤弧菌(登录号AF230955.1)同源性达94%;系统进化树分析表明,PYMc14-2与创伤弧菌(登录号AF230955.1)聚为一簇,初步鉴定该菌为创伤弧菌。

诸氏鲻虾虎鱼“溃烂病”病原及其致病影响因子分析

为研究诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)"溃烂病"病原及其致病性,对患病鱼进行了病原分离、人工感染实验以及病原生理生化鉴定和gry B分析,研究了不同温度、盐度、p H条件对其致病性的影响。结果显示,病原菌为迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda),对诸氏鲻虾虎鱼和斑马鱼(Danio rerio)的半致死剂量(LD50)分别为57 CFU·尾^(–1)和2.0×10~4 CFU·尾^(–1),毒力基因(cit C、muk F、esr B、kat B、fim A、gad B)检测结果均为阳性,其基因序列与已知迟缓爱德华菌相应的毒力基因序列同源性高达99%。病理结果显示,患病鱼肾脏、肝脏、皮肤细胞均出现不同程度的变性、坏死和炎性细胞浸润等,其中肾和肝组织病变最为严重。25℃和30℃实验组5 d累计死亡率分别为(33±15)%、(60±10)%,显著高于20℃实验组和对照组(P<0.05);盐度15和30实验组5 d累计死亡率分别为(60±10)%、(63±21)%,显著高于盐度3实验组[(20±10)%,P<0.05];而p H 6.0、p H 7.5、p H9.0实验组之间5 d累计死亡率无显著差异(P>0.05)。结果表明,迟缓爱德华菌是诸氏鲻虾虎鱼"溃烂病"病原,具有强致病性,养殖温度和盐度对其致病性具有显著影响。

诸氏鲻虾虎鱼染色体组型分析

通过研究诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)的染色体,分析了该鱼的细胞遗传学特征。取该鱼胚胎细胞,经秋水仙素浸泡、低渗处理、卡诺氏固定液固定后,用常规空气干燥法制作染色体标本,吉姆萨(Giemsa)染色后对获得的中期分裂相进行核型分析。研究结果表明,诸氏鲻虾虎鱼的染色体数目(2n)为44,核型为10m+10sm+4st+20t,染色体总臂数(NF)为64,未发现多倍体现象,也未发现异型性染色体和随体。

诸氏鲻虾虎鱼实验动物化研究进展

诸氏鲻虾虎鱼是我国特色海洋鱼类,具有诸多实验动物培育与应用优势。本文概述了诸氏鲻虾虎鱼的生物学特性、封闭群和近交系培育、质量控制等实验动物化研究进展,并介绍了诸氏鲻虾虎鱼作为海洋实验鱼类在海洋环境监测、水生态毒理等研究中的应用。结合目前研究和应用现状,对诸氏鲻虾虎鱼的质量标准化、近交系培育及其在功能基因组等领域的应用进行了展望。

GFP标记的迟缓爱德华菌感染诸氏鲻虾虎鱼后组织分布研究

为探讨迟缓爱德华菌(Edwarsiellatarda)入侵途径,建立感染模型,作者通过电转化法构建GFP标记的迟缓爱德华菌EtMc1512(质粒PMDpp-EGFP),实验设立浸泡组、腹腔注射组和肌肉注射组,感染后采集各组实验诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)血液、鳃、肝脏、肠、肌肉,培养法统计分析各组织中的荧光细菌数;浸泡组取样时间为0、2、4、6、8、12、24 h,腹腔注射组和肌肉注射组取样时间为6、12、24、48、72、96h。结果显示,构建的EtMc1512-GFP具有较强荧光,GFP标记前后菌株毒力基因(citC、mukF、esrB、katB、fimA、gadB)检测结果均为阳性。浸泡感染后实验鱼各组织内的荧光菌随时间表现为先升后降的趋势,最高菌量出现在肠道(2.51×106CFU/g),其次为鳃(4.19×104CFU/g)、血液(1.65×104CFU/g),肠道荧光菌显著高于其他组织(P<0.05);腹腔注射感染后肝脏(4.55×106CFU/g)和血液(4.65×106CFU/g)菌量最高;肌肉注射感染后肌肉在48h首先检出荧光菌,血液(2.93×104 CFU/g)菌量最高。结果表明,肠道、肝脏和肌肉分别是迟缓爱德华菌浸泡感染、腹腔注射感染和肌肉注射感染诸氏鲻虾虎鱼的主要组织器官,在自然条件下迟缓爱德华菌经口感染诸氏鲻虾虎鱼风险较高。

诸氏鲻虾虎鱼的形态与生长特性分析

目的研究室内人工繁育诸氏鲻虾虎鱼的形态与生长特性，为其开发应用积累生物学资料。方法室内恒温（24℃～26℃）培育诸氏鲻虾虎鱼，采用SPSS软件分析其形态、生长特征参数。结果雌雄诸氏鲻虾虎鱼体长／头长、头长／眼径、头长／尾柄长、头长／尾柄高4项比例性状差异显著；全长、体长、体质量与日龄的关系式分别为LT=5.2×10-7t30．0007tz＋0．2583t＋0．5666（R2=0．995）、LB=4．6×10-7t3—0．0006t0＋0．2239t＋0．477（R2=0．993）、WB=-8．0×10’t3—0．0002t0＋1．7226t．63．732（R2=0．997）；体长与体质量的关系式为W=0．0136LB3.1103（R2=0．977）；Bertalanffy模型也可较好拟合诸氏鲻虾虎鱼的全长、体质量与日龄关系，拟合曲线分别为：Lt=37．5×（1-0．6e-0.012t）3；Wt=775．7×（1-1．68e-0.08t）3；诸氏鲻虾虎鱼的肥满度随个体生长而逐渐升高；雄鱼生长较快。结论诸氏鲻虾虎鱼全长、体长和体质量的日增长率呈下降趋势；全长、体长的日均增长量在仔、稚鱼期逐渐增加，其后增速减慢；体质量的日均增长量从幼鱼期至成鱼期逐渐增加，250日龄后则呈下降趋势：个体生长差异较小。

诸氏鲻虾虎鱼幼鱼饲料纤维素适宜含量的初步研究

为探讨纤维素含量对诸氏鲻虾虎鱼幼鱼生长的影响,配制了6种不同纤维素含量的配合饲料,饲喂60日龄幼鱼8周,测定存活率(SR)、增重率(WG)、特定生长率(SGR)、摄食率(FR)、饲料系数(FCR)和肥满度(FUL),切片观察各组虾虎鱼的肠道,并测定鱼体基本组分(粗蛋白、粗脂肪、水分和灰分)。结果表明,幼鱼SR随纤维素含量的增加逐渐下降;WG和SGR先上升后下降;FR持续上升,但组间无显著差异;饲料纤维素含量超过2.98%时,幼鱼FUL持续下降;纤维素含量由14.52%增加到20.63%时,FCR极显著增大。同时纤维素含量影响虾虎鱼幼鱼肠道形态,并对鱼体粗蛋白、粗脂肪含量有显著影响,但对水分、灰分均无显著影响。诸氏鲻虾虎鱼幼鱼饲料最适纤维素含量为6.74%。

不同发育期诸氏鲻虾虎鱼对钻井液的敏感性比较

目的筛选试验鱼适宜急性毒性试验的发育期。方法将诸氏鲻虾虎鱼早期仔鱼、中期仔鱼、晚期仔鱼、稚鱼、幼鱼及成鱼暴露于一定浓度的钻井液中,比较钻井液对不同发育期诸氏鲻虾虎鱼的急性毒性。结果早期仔鱼48 h LC50为157 mg/L,中期仔鱼48 h LC50大于500 mg/L;中期仔鱼96 h LC50为79 mg/L,晚期仔鱼96h LC50为625 mg/L,稚鱼、幼鱼、成鱼96 h LC50显著大于500 mg/L;卤虫无节幼体96 h LC50为105 mg/L;不同发育期诸氏鲻虾虎鱼对钻井液的敏感性顺序为:早期仔鱼>中期仔鱼>晚期仔鱼>稚、幼、成鱼。结论诸氏鲻虾虎鱼的早期仔鱼适用于海洋污染物急性毒性评价。

不同饲料对诸氏鲻虾虎鱼生长和利用效果的影响

目的初步探讨过渡期诸氏鲻虾虎鱼的营养需求,为专用配合饲料的开发及相关标准的制定提供数据参考。方法分别采用卤虫无节幼体（Arternia nauplii,CK）和7种商业化配合饲料（P30L8,P35L8,P50L8,P55L8;P50L12,P53L12,P55L12）饲喂过渡期虾虎鱼幼鱼,8周生长实验以测定存活率（survival rate,SR）、增重率（weight gain,WG）、特定生长率（specific growth rate,SGR）和摄食率（feeding rate,FR）、饲料系数（feed conversion ratio,FCR）等生长指标,并测定不同营养水平下虾虎鱼全鱼（除去内脏）的基本组份。结果 SR饲料组SR（51.78±8.98～68.22±4.95）较对照组CK（58.22±6.51）均无显著差异（P〉0.05）;WG除P30L8（130.76±23.67）、P50L12组（220.86±16.9）外,各实验组均优于对照组CK（206±41.91,P〈0.05）,且饲料粗脂肪含量相同（8%,12%;能量值相差不大）时,WG随饲料粗蛋白含量的升高而上升;SGR在粗脂肪含量相同时SGR也随饲料粗蛋白含量的升高而上升;FR,FCR P50L8,P55L8;P50L12,P53L12,P55L12组均优于对照组CK（1.74±0.36）,且饲料粗脂肪含量8%时随粗蛋白含量上升而下降。此外虾虎鱼鱼体基本组份均与饲料中粗蛋白、粗脂肪含量关系不大（P〈0.05）。结论配合饲料饲替代生物饵料是可行的,且能取得较好的生长效果;饲料粗蛋白、粗脂肪含量对虾虎鱼鱼体基本组份影响不显著（P〈0.05）;饲料粗蛋白50%,粗脂肪8%时,饲料利用率最好且过渡期虾虎鱼可获得较好的生长效果。

水基钻井液对诸氏鲻虾虎鱼抗氧化酶的影响

目的 研究我国南海区某海洋钻井水基钻井液对诸氏鲻虾虎鱼抗氧化酶的影响.方法在19.75～158 mg/L浓度下,对3月龄诸氏鲻虾虎鱼染毒,并用试剂盒法测定超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性.结果 SOD对水基钻井液的毒性暴露不太敏感,在染毒第1天只有最低浓度组受到一定程度的抑制,染毒第2 天各浓度组酶活性均受到一定程度的诱导（12.4%～25.5%）,这种诱导作用在第4天即有所减弱,之后酶活性的变化变缓.CAT则对水基钻井液表现出较强的敏感性.染毒第1 天,各组酶活性均受到明显的诱导,并且各组酶活性表现出明显的浓度效应关系.最高浓度组酶活性最大诱导率达到97%（P＆gt;0.05）.随后虾虎鱼CAT酶活性逐渐下降,第7 天,各染毒组酶活性的抑制率达到58.4%～89.1%.结论 CAT在中毒反应中表现出了敏感性,具备了作为生物标志物的重要条件,有望在今后的实际应用中发挥作用.

诸氏鲻虾虎鱼出血病病原鉴定及传播途径分析

目的分离鉴定诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)出血病病原,并探讨其传播途径,为虾虎鱼微生物质量控制提供技术依据。方法从患出血病虾虎鱼肝脏取样分离病原菌,经菌落形态、生化特性和分子特征鉴定细菌,回归感染确定其致病性,并采用双重PCR方法对虾虎鱼、轮虫、卤虫、水进行嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)检测。结果分离到1株优势菌PYMc15-1,该菌株API生化反应结果与嗜水气单胞菌一致,gry B序列与Gen Bank上的嗜水气单胞菌相应基因序列同源性最高;根据已知序列构建gry B分子系统进化树,分离株PYMc15-1与嗜水气单胞菌聚类;分离株PYMc15-1溶血素基因(hly A)和气溶素基因(aer A)检测结果阳性,对虾虎鱼半致死剂量(median lethal dose,LD50)为每尾1.2×104cfu。野生虾虎鱼、卤虫和野生轮虫致病性嗜水气单胞菌检测出现阳性结果,虾虎鱼封闭群、室内培育的轮虫以及海水样品致病性嗜水气单胞菌检测均为阴性。结论嗜水气单胞菌可自然感染虾虎鱼;野生虾虎鱼和生物饵料是其潜在传播媒介,引进虾虎鱼和生物饵料时应检测该病原。

不同发育阶段诸氏鲻虾虎鱼对水污染物的敏感性比较

目的 筛选诸氏鲻虾虎鱼适宜急性毒性试验的发育阶段.方法 以十二烷基硫酸钠为参比毒物,比较研究诸氏鲻虾虎鱼胚胎、早期仔鱼、中期仔鱼、晚期仔鱼、稚鱼及幼鱼对毒物的敏感性.结果 不同发育阶段诸氏鲻虾虎鱼对SDS的敏感性依次为：早期仔鱼＞胚胎＞中期仔鱼＞晚期仔鱼＞稚鱼＞幼鱼.结论 诸氏鲻虾虎鱼早期仔鱼在水污染物急性毒性评价方面具有显著的优势.

诸氏鲻虾虎鱼封闭群遗传质量评价方法的建立

目的分析诸氏鲻虾虎鱼封闭群和野生群的遗传差异,建立诸氏鲻虾虎鱼封闭群遗传质量评价方法。方法利用20个微卫星标记对诸氏鲻虾虎鱼野生群和封闭群进行STR分型,计算群体间遗传杂合度和遗传分化状况,并分析样本量对遗传参数的影响。结果诸氏鲻虾虎鱼封闭群和野生群在20个微卫星位点的平均无偏期望杂合度(He)分别为0.6927和0.7162。封闭群与野生群间遗传分化较小,且当样本量达到30尾以上后,平均等位基因数趋于稳定。结论遗传杂合度是否在0.5~0.7之间可较好将诸氏鲻虾虎鱼封闭群与野生群区分,适于作为诸氏鲻虾虎鱼封闭群遗传质量合格与否的判定指标。

卤虫无节幼体和配合饵料饲喂诸氏鲻虾虎鱼效果比较

为比较卤虫无节幼体(Arternia nauplii)和配合饵料的饲喂效果,分别采用两种饵料饲养30日龄的诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)75d,比较存活、生长和全鱼成分。结果表明,卤虫组的存活率较高(≥52%),显著高于配合饵料组(14%～21%);配合饲料组的相对增重率(GW)为2 916.8%～3 998.7%,特定生长率(SGR)为4.5～5.0,生长效果优于卤虫组(GW为1 826.5%～2 101.7%,SGR为3.9～4.1);全鱼成分测定,卤虫组的水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分含量分别为72.7%、19.5%、4.7%、3.0%,配合饵料组的分别为70.5%、18.7%、5.8%、3.5%,两组没有显著差异。适当延长饲喂卤虫无节幼体的时间,然后采用配合饵料进行饲养,能提高存活率并获得较好的生长效果。

DDT、苯并[a]芘暴露对阿部鲻虾虎鱼P糖蛋白mRNA表达的影响

建立了阿部鲻虾虎鱼(Mugilogobius abei)P糖蛋白(P-gp)mRNA荧光定量RT-PCR检测方法,利用该检测方法探讨不同时间、不同浓度DDT和苯并[a]芘(BaP)暴露对阿部鲻虾虎鱼P-gp基因表达的影响。结果显示,该检测方法能在低质量浓度污染物(0.01 mg·L-1DDT、0.005 mg·L-1BaP)暴露下检测到P-gp基因表达量的显著变化(P<0.05)。P-gp基因在正常阿部鲻虾虎鱼肌肉、肝脏、心脏、肠、脑组织中均有表达,在鳃、脾组织中没有检测到表达,DDT和BaP能诱导肝脏和脑中P-gp基因表达量升高。2种污染物暴露5 h均可诱导肝脏表达量的显著变化,随着暴露时间延长,表达量均升高,24 h达到较高表达量。低质量浓度DDT和BaP均能诱导肝脏P-gp基因表达,并呈现良好的剂量-效应关系,而高质量浓度均抑制P-gp的表达。DDT和BaP可影响阿部鲻虾虎鱼肝脏P-gp基因表达,其变化可作为生物标志物,来评价化学污染物对水生动物的生物学效应。

苯并[a]芘诱导阿部鲻虾虎鱼细胞色素P4501A1表达的研究

为了解苯并[a]芘(BaP)对鱼类细胞色素P4501A1(CYP1A1)表达的影响,以阿部鲻虾虎鱼(Mugilogobius abei)为试验材料,研究BaP诱导前后鱼体各组织CYP1A1表达情况和质量浓度为0.005 mg/L、0.025 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、2mg/L BaP暴露后肝脏CYP1A1表达情况。结果表明:CYP1A1基因在正常鱼体的鳃、肌肉、肝脏、脾脏、心脏组织中均有表达,其中肝脏中表达量最高;BaP诱导后,在鳃、肝脏、心脏中表达量分别升高到诱导前的1.3倍、21.6倍和1.3倍;肝脏CYP1A1基因表达量在5 h、12 h、24h分别为诱导前的1.8倍、4.9倍和21.6倍;不同质量浓度BaP暴露24 h后,肝脏CYP1A1基因和蛋白表达量比对照组均有显著性升高(p<0.05),0.1 mg/L暴露组表达量均最高。研究表明,BaP对CYP1A1具有较强的诱导作用,阿部鲻虾虎鱼CYP1A1变化适于作为BaP暴露的敏感生物标志物,可以用来显示暴露于多环芳烃有机污染物鱼类的生活状态。