目的研究诺如病毒的基因特征和变化规律,预测诺如病毒的进化方向及流行趋势,为预防诺如病毒病的暴发打下良好基础。方法采用RNA提取试剂Trizol提取诺如病毒毒株RNA,采用试剂盒TaKaRa Ex TAP进行PCR扩增,利用Bioedit软件对基因序列进行拼...目的研究诺如病毒的基因特征和变化规律,预测诺如病毒的进化方向及流行趋势,为预防诺如病毒病的暴发打下良好基础。方法采用RNA提取试剂Trizol提取诺如病毒毒株RNA,采用试剂盒TaKaRa Ex TAP进行PCR扩增,利用Bioedit软件对基因序列进行拼接,然后对基因序列分析。将PCR扩增出的P区域克隆到表达载体,构建原核表达质粒。在大肠埃希菌中表达P蛋白,重组蛋白经SDS-PAGE凝胶分离检测。以ABO血型健康人唾液为受体研究P粒子与唾液HBGA结合能力,检测方法采用间接ELISA法。结果实验用诺如病毒毒株与GⅡ.4流行株在RdRp区的核苷酸序列同源性达到94%以上,其中US95/96株94%,Farmington Hills株94.2%,Hunter株94.7%,DenHaag2006b株95.8%,Osaka2007株96.5%,NewOrleans2009株97.2%,Sydney2012株98.4%。实验株与GⅡ.4流行株在衣壳蛋白区的核苷酸序列同源性达到94%以上,其中US95/96株94.3%,Farmington Hills株94.1%,Hunter株95.2%,DenHaag2006b株96.3%,Osaka2007株96.8%,NewOrleans2009株97.8%,Sydney2012株98.6%；氨基酸同源性达到96%以上,其中US95/96株为96.1%,Farmington Hills株96.3%,Hunter株97.1%,DenHaag2006b株96.8%,Osaka2007株97.3%,NewOrleans2009株97.8%,Sydney2012株98.9%。实验株在RdRp区核糖核苷酸序列的与Neworleans2009和Sydney2012同源性较高,实验株中P2区氨基酸位点发生多点位定向突变,如P2区第95位由天冬酰胺（N）突变为组氨酸（H）。重组蛋白经SDS-PAGE凝胶分离检测产物大小为35ku的目的蛋白表达。检测P粒子与唾液HBGA结合能力（A450值）血型A为3.815.12；血型B为3.124.05；血型O为2.853.51。结论诺如病毒在遗传上具有多样性,变异快的特点,因而很难有疫苗对它长期安全有效。通过对GII.4型基因序列的研究,有助于寻找其关键位点变化规律和流行株进化机理,有助于预测诺如病毒的进化方向及流行趋势。展开更多
文摘目的分析诺如病毒(Novirus, NoV)GII.4型济南JN010株基因组序列及其特征。方法根据文献并结合PrimerSelect软件设计7对引物,利用RT-PCR方法获得NoV济南JN010株全基因组序列,应用Lasergene7.1、MEGA5.2等软件对基因组序列进行遗传进化、同源比对分析,建立ORF1及ORF2基因系统进化树。并根据VP1氨基酸序列进行突变分析。结果NoV JN010株基因组序列全长7 516 bp,为GII.Pe/GII.4基因型,属于GII.4 Sydney 2012变异株。突变位点主要发生在VP1的P2区,其中抗原表位A及与组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)结合位点A处发生R297H突变,毗邻抗原表位A位点发生I293N和H373N突变。根据ORF1基因序列,JN010株与日本Osaka源病毒株(GenBank登录号LC066046)亲缘关系较近;根据ORF2基因序列,与广东中山源病毒株(GenBank登录号KY407064)亲缘关系较近。结论NoV JN010株VP1在抗原表位A及与HBGAs结合位点发生突变,可能影响其抗原性及与HBGAs结合的特异性。
