用RT-PCR法检测食品中诺沃克样病毒

使用RTPCR法对贝类样品中的诺沃克样病毒进行了检测。对食品中不同的病毒富集方法进行了研究,评价了CHCl3和Frezon去除RTPCR抑制剂的效果,筛选出最佳的病毒富集方法即2次PEG6000(终浓度12%PEG6000,03mol/LNaCl)沉降病毒,并使用CHCl3除去RTPCR抑制剂。此富集方法的回收率为135%。另外,对不同的RNA提取方法的灵敏度进行了比较,最终确认硅胶膜法为简便、快速、有效的RNA提取方法。并且,使用了Superscript反转录酶进行反转录,提高了检测的灵敏度。选用了289和290混合引物进行食品中NLVs的检测,这一引物组合可同时检测Ⅰ型和Ⅱ型NLVs,扩增出1个319bp的特异性片段。通过以上条件的优化,建立了通过RTPCR检测贝类中NLVs的有效方法。该方法的NLVs最低检出限为10×103RT-PCR50/15g。对32件贝类样品进行了NLVs的检测,其中2份毛蚶中被检出NLVs。

用RT-PCR和ELISA对暴发性急性胃肠炎事件中诺沃克样病毒检测的比较

目的 诺沃克样病毒是世界范围内急性非细菌性流行性胃肠炎的重要病原。采用RT-PCR和ELISA两种方法对广州市多起暴发性急性胃肠炎事件中病人标本进行诺沃克样病毒检测 ,了解广州市诺沃克样病毒流行情况 ,并对RT-PCR和ELISA两种检测方法进行比较。方法 用RT-PCR和ELISA对 76份腹泻病人粪便 ,2 3份肛拭子 ,12份食物进行诺沃克样病毒检测。结果 粪便通过RT-PCR检出阳性 37份 ,ELISA检出阳性 17份 ,肛拭子仅通过RT-PCR检出 1份阳性 ,食物无阳性检出。结论 这是首次我国实验室证实的由诺沃克样病毒引起的急性胃肠炎暴发。RT-PCR的阳性率大于ELISA ,且检品以粪便为好。并且我们的分离株与诺沃克原型株相应序列比较的同源性大于 90 %

实时定量RT-PCR方法检测太平洋牡蛎中的诺沃克样病毒

建立了Taqman实时定量RT-PCR方法检测诺沃克样病毒(Norwalk-like Virus,NLV)的方法,并对中国的牡蛎样品进行了分析。选取GⅡ型NLV的RNA聚合酶区域,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针,建立了定量RT-PCR反应体系。将含有NLV扩增片段的质粒10倍梯度稀释,作为标准品进行反应以确定检测灵敏度并制备标准曲线。结果表明,质粒密度在6×106,6×105,6×104,6×103,6×102,6×101,6个拷贝之间,共7个数量级的范围内,定量RT-PCR反应都有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为6个拷贝。制备的标准曲线中,病毒拷贝数(X)与Ct值的关系为Ct=-3.36lgX+37.11,相关系数R2=0.998。对中国37批太平洋牡蛎(Crassostrea gigas Thunberg)样品进行了定量检测,有6批样品为阳性,并根据标准曲线测定了NLV的含量。

RT-PCR方法检测贝类中诺沃克样病毒的研究

目的:本研究从病毒富集和核酸提取两方面进行探索,旨在建立一个反转录(RT)PCR技术检测贝类中诺沃克样病毒(NLVs)的方法。方法:利用脊髓灰质炎病毒作为参照毒株,优化了甘氨酸缓冲液-聚乙二醇(PEG)病毒浓缩方法;同时比较了异硫氰酸胍法、SDS-蛋白酶K法、Trizol-异丙醇法、试剂盒法四种RNA提取方法;对市售贝类样品进行了检测,并利用基因测序对阳性样品进行验证。结果:本研究采用的pH9.5甘氨酸缓冲液-16%聚乙二醇病毒浓缩法,病毒的回收率为16.8%,利用Trizol-异丙醇法提取RNA,检出限为8.1×102RT-PCR50/5g贝肉,实际检测贝类样品25件,其中3件样品为阳性,基因测序结果亦证实为阳性。结论:本研究建立了一个灵敏度较高、较为有效的RT-PCR技术检测贝类中诺沃克样病毒的方法。

诺沃克样病毒广州地区分子流行病学分析

目的根据广州市多起由诺沃克样病毒引起的食物中毒患者粪便标本中检测到的Ⅱ型诺沃克样病毒序列,初步了解广州地区诺沃克样病毒的分子流行病学情况。方法用RT-PCR对病人粪便中的诺沃克样病毒核酸进行扩增,将阳性产物测序,并与GenBank中的序列相比较。结果归纳出4个代表性序列,并且相似率都不高。结论我国存在诺沃克样病毒引起的食物中毒,而其RNA复制酶的保守区段变异普遍较大。

诺沃克样病毒分子生物学研究进展

本文着重对诺沃克样病毒 (NLV )分子生物学的研究进展 ,包括毒粒的形态结构、基因组成和分子流行病学特点及预防等问题给予综述介绍。

暴发性胃肠炎中诺沃克样病毒的检测

目的 确定暴发性胃肠炎中诺沃克样病毒的检测方法。方法 对2 0 0 3年10月和2 0 0 4年3月广东省疾病预防控制中心收集到的2起(广州市、江门市各1起)急性胃肠炎暴发患者的粪便和肛拭子标本,采用针对诺沃克样病毒的特异引物和逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)技术进行检测,再经核苷酸序列测定方法证实,并与酶联免疫方法进行比较。结果 用RT PCR进行检测,12份急性期粪便标本(广州标本)中诺沃克样病毒阳性11份,13份肛拭子(江门标本)中阳性4份;用酶联免疫方法进行检测,11份粪便标本中有8份阳性,13份肛拭子标本均为阴性;阳性样本经序列分析证实为诺沃克样病毒GⅡ组,其中从广州标本中所获得的广州株与af39913的核酸相似性为96 7% ,从江门标本中所获得的江门株与saitamaU4毒株的核酸相似性为94 5 %。结论 采用PCR和酶标方法可有效地进行粪便的诺沃克样病毒检测。

诺沃克样病毒性胃肠炎259例临床分析

目的:探讨诺沃克样病毒性胃肠炎(GNV)诊断和治疗。方法:2008年2月～2009年7月、2009年12月～2010年2月、2010年6月～2010年8月间,我院对分别接诊100例、51例、108例符合GNV诊断标准的患者259例进行回顾性总结分析。结果:GNV259例患者,其中误诊81例,误诊率为31.1%。误诊病例:腹痛待查43例(53.3%)、阑尾炎11例(13.6%)、肠痉挛8例(9.8%)、胰腺炎6例(7.4%)、肝炎5例(6.2%)、胆囊炎5例(6.2%)、脑供血不足1例、肠梗阻1例和剖腹探查1例。恶心腹痛259例,其中阵发性腹部绞痛58例(22.4%)、腹泻55例(22.2%)、低热35例(13.5%)、呕吐14例(5.4%)和上呼吸道感染症状13例(5.02%)。结论:以流行病学所提供的资料表明,该病从2008～2010年3年之中连续流行3次,推测今后还有发生流行的可能。根据流行病学特点和临床表现,可以对GNV做出正确诊断。GNV误诊病例繁多,几乎遍及腹部每个脏器,结果出现各种各样的临床症状。甲氧氯普胺对解除恶心、腹痛尤其对痉挛性腹痛有特效。

地中海型餐厅相关性胃肠炎与诺沃克样病毒

本文对多变感染原，Norwalk样病毒(NLV)与三次连续的(餐厅相关)的胃肠炎暴发的重要性进行评价。作者采用标准细菌学试验方法、大肠杆菌特异试验、vero毒素试验，电镜(EM)观察病毒及反转录PCR(RT—PCR)方法研究NLV。经以上方法无病原菌检出。在第一次暴发时，虽然以PCR检出vero毒素基因，但在大肠杆菌分离株中不能确定，故无意义。NLV是三次暴发中多次检测的重要对象。RT—PCR扩增产物阳性样的DNA序列和系统发育分析表明，仅NLV株与多次暴发相关，但NLV株对三次暴发的作用各不相同。PCR检测NLV敏感性高，但用EM都不能检出一例阳性样，与餐厅相关的暴发属地中海型餐厅，在这类餐厅，通常碟子中的食物直接用手指食用。试验分析表明，NLV是由客人或餐厅员工带人，而非因长期安置的贮水池引起。

广州地区人类杯状病毒感染的初步研究

目的了解广州地区儿童中是否存在人类杯状病毒(HuCV)感染并初步探讨其感染水平。方法用ELISA法和RT-PCR分别检测266份不同年龄段儿童血清中诺沃克样病毒(NLV)的rNV、rMX和r387特异性IgG抗体和粪便标本中的HuCV RNA并将扩增目的产物同基因文库中的病毒序列进行比较分析。结果血清中的rNV、rMX和r387IgG抗体阳性率分别为68.0%、51.5%和71.1%。腹泻高峰期收集的100份散发非菌性胃肠炎病例粪便标本中检出HuCV4株,均为NLV。在广州某学校暴发型非细菌性胃肠炎患者的10份标本中检出NLV3株。结论广州地区存在NLV引起的散发和暴发性非菌性胃肠炎,当地儿童在婴幼儿期即获得NLV感染,感染率有随年龄增加而升高的趋势。

致病的诺如病毒分子生物学特点研究

诺如病毒（Norovirus）为一组杯状病毒科的病毒,也可以将其称之为“诺沃克样病毒”，为1968年在美国俄亥俄州诺沃克镇腹泻暴发中被发现的，1972年通过免疫电镜证实它是引起急性胃肠炎的主要原因之一，之后国内外对其研究逐渐变得广泛。笔者对241例非细菌性胃肠炎患者的临床资料进行回顾性分析及深入调查，对诺如病毒的分子生物学特点进行分析与研究，现将具体的研究过程及结果报告如下。