多重调理吞噬试验方法的重复性和再现性研究

目的研究中国食品药品检定研究院（以下简称＂我院＂）建立的多重调理吞噬试验方法（MOPA）的重复性和再现性。方法采用MOPA方法对19份血清样本,针对13个血清型肺炎球菌的体外调理吞噬试验（OPA）滴度在我院及美国阿拉巴马大学肺炎链球菌血清学参比实验室分别进行两轮检测,对两个实验室间检测结果及本室的两轮试验结果进行比较分析。结果总体上,13个血清型的总的OPA滴度比较比较显示,两个实验室间相关系数为0.94,本室内部则可达到0.96,均呈现出良好的相关性。另一方面,各血清型的两实验室间和我院内相关系数范围分别为0.87-0.99和0.68-0.99。结论我院建立的MOPA方法具有良好的重复性和再现性,为我国开展肺炎链球菌疫苗的免疫保护效力评价工作奠定了良好的基础。

不同来源HL60细胞用于调理吞噬杀菌试验的比较

目的通过比较不同来源的HL60细胞分化后细胞的表面标志、活性及其对肺炎链球菌调理吞噬杀菌指数的动态变化，评价HL60细胞的来源对肺炎链球菌调理吞噬杀菌能力的影响。方法使用流式细胞仪连续监测来源于美国ATCC和中国科学院上海细胞研究所的HL60细胞在分化后1～7d的表面标志CDllb、CD35和CD71的表达情况，并观察活细胞、凋亡细胞和死亡细胞的比例；同时使用两种不同来源的细胞检测09CS和B两份质控血清对肺炎链球菌血清型6B、7F、14和23F菌株的调理吞噬杀菌指数，同时观察09CS对13价结合疫苗血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F菌株的调理吞噬杀菌指数。结果两种不同来源HL60细胞分化3～6d细胞的表面标志、活细胞比例均可达到国际实验室的要求指标；两份质控血清对检测菌株的调理吞噬杀菌指数均能稳定于质控范围之内；两种细胞检测的09CS对13价肺炎链球菌结合疫苗血清型菌株的调理吞噬杀菌指数具可比性。结论两种来源不同的HL60细胞分化3-6d均能用于评价肺炎链球菌疫苗免疫血清的调理吞噬杀菌试验，这为调理吞噬杀菌试验及其标准化在国内的建立提供了便利。

多型调理吞噬试验方法的长期稳定性

目的通过对2010—2016年间09CS针对13个型别的肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体滴度的分析,探讨调理吞噬杀菌试验(multiplexed opsonophagocytic killing assays,MOPA)的长期稳定性。方法统计2010—2016年检测人肺炎链球菌质量控制血清(质控血清)09CS中针对1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F共13个血清型的OPKA滴度,分别计算2010、2011、2012、2013、2014—2016年09CS针对各个型别的OPKA滴度的GMT值及其95%可置信区间;统计09CS针对13个血清型的OPKA滴度在质量控制范围之内的比率;计算2010—2016年09CS针对13个血清型各型别的OPKA滴度CV值。结果从OPKA滴度来看,2010年普遍较低,而2011年、2012年、2013年、2014—2016年这几年间的09CS针对13个血清型的滴度结果稳定。2011—2016年期间检测结果在质控血清滴度范围的比率:2010年最低值是4%,均值为30%;2011年最低值是65%,均值为80%;2012年最低值是73%,均值为85%;而2013年最低值为77%,均值为94%;2014—2016年最低值为71%,均值为90%。2010—2016年09CS针对13个血清型的OPKA滴度各型别CV:各年份的平均值分别为:125%、64%、47%、41%和39%。结论充分证明了从2011年起本实验室建立的MOPA稳定性良好。

HL-60分化细胞表面标志、活性及其对肺炎链球菌调理吞噬杀菌能力的动态变化

目的分析HL-60分化细胞的表面标志、活性及其对肺炎球菌调理吞噬杀菌能力的动态变化。方法以流式细胞仪连续监测分化1～7 d的HL-60细胞表面标志CD11b、CD35和CD71的表达以及活细胞、凋亡细胞和死亡细胞的比例,同时用09CS、QC2、B、C和F 5份质控血清以调理吞噬杀菌试验检测肺炎链球菌血清型6B、7F、14和23F的杀菌滴度。结果分化3～6 d的HL-60细胞表面标志、活细胞比例可达到实验室要求,5份质控血清的调理吞噬杀菌滴度稳定而且在质控范围之内。结论分化3～6 d的HL-60细胞可以用于评价肺炎链球菌疫苗免疫血清的调理吞噬杀菌试验,为调理吞噬杀菌试验的建立和标准化提供了依据。

评价肺炎链球菌多糖结合疫苗效力的调理吞噬试验条件的优化

目的优化评价肺炎链球菌多糖结合疫苗效力的调理吞噬试验(Opsonophagocytic assay,OPA)的条件。方法参考美国阿拉巴马大学的WHO指定实验室于2007年1月发布的A.02版实验规程,优化OPA的试验条件。分别以抗性和非抗性肺炎链球菌菌株作为靶细菌检测其对应型结合物受试血清的调理吞噬效价后,再与相应的ELISA效价比较,分析二者的相关性。结果 0.8%二甲基甲酰胺(DMF)诱导HL-60细胞分化4d后,细胞表面标志表达量分别为:CD11b和CD35≥55%、CD71≤15%,活细胞比例≥65%;各型肺炎链球菌工作种子批的复活率≥80%;补体的非特异性杀伤率为18%;各血清型均表现出良好的杀菌活性,且OPA法与ELISA法测定的血清抗体效价比较,相关系数和斜率非常接近。结论优化的OPA条件符合该试验要求,可用于肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗的效力评价。

13价肺炎球菌多型调理吞噬试验方法的建立及验证

目的建立标准化的针对肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体的多型调理吞噬试验(multiplexed opsonophagocytic killing assay,MOPA)方法,并进行验证。方法参照有关组织研究和发布的MOPA实验操作规范(UAB-MOPA),通过菌种鉴定、HL60细胞分化规律的确定、补体筛选、质控血清质控范围的确定,建立本实验室的MOPA实验方法,并对方法进行特异性、线性、精密性、准确性以及耐受性验证。结果工作菌种的所有指标均符合UAB-MOPA操作规范的要求;HL60细胞在分化后3~6 d均可作为工作细胞使用;27531和84321N两批补体可作为工作补体使用;建立了09CS、QC2、B、C和F 5个质控血清的质控范围。方法的特异性、线性、精密性、准确性及耐受性均符合预定指标。结论成功建立了标准化的13价肺炎球菌多型MOPA方法,并进行了验证。

人肺炎球菌参考血清09CS的制备及其中13个肺炎球菌结合疫苗血清型抗体的IgG含量和调理吞噬滴度

目的制备人肺炎球菌参考血清,对其中13价肺炎球菌结合疫苗(pneumococcal conjugate vaccine,PCV)血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F型)的抗荚膜多糖抗体Ig G含量和调理吞噬滴度进行定值。方法用23价肺炎荚膜多糖疫苗免疫20名健康成人,采集免疫后血浆,进行混合、去纤维蛋白原、过滤、分装、冻干,制备人肺炎球菌参考血清09CS。在WHO细菌性呼吸道病原参考实验室(University of Alabama at Birmingham,UAB)和兰州生物制品研究所有限责任公司(Lanzhou Institute of Biological Products,LIBP)实验室,采用WHO推荐的Pn PS ELISA法,以国际标准血清89SF为标准,对其中13价PCV血清型抗荚膜多糖抗体Ig G含量定值;以临时定值的09CS为标准,检测12份WHO校正血清、16份LIBP质控血清和89SF,对定值的准确性进一步验证。同时以调理吞噬杀菌试验(opsonophagocytic killing assay,OPA)测定针对13个血清型的调理吞噬滴度。结果制备了5 000支(0.5 ml/支)冻干人肺炎球菌参考血清09CS,残留水分含量2.3%。确定了09CS中13价PCV血清型抗荚膜多糖抗体Ig G含量的临时定值;以09CS为标准检测的12份WHO校正血清和16份LIBP质控血清的13价PCV血清型抗荚膜多糖抗体结果,与以89SF为标准检测的结果,均具有良好的直线相关关系(r≈1.00,P<0.05);以09CS为标准检测的89SF的13价PCV血清型抗荚膜多糖抗体的新值与其原定值比较,各血清型的误差百分率的绝对值均<20%。确立了09CS中13价PCV血清型调理吞噬滴度。结论 LIBP成功制备了人肺炎球菌参考血清09CS,完成了对其中的13价PCV血清型抗荚膜多糖抗体Ig G含量的准确定值,并确定了调理吞噬滴度。

评价肺炎链球菌疫苗免疫效果的功能性抗体检测方法的建立

目的建立肺炎球菌疫苗免疫效果评价的功能性抗体滴度检测方法。方法参考美国阿拉巴马大学的多重调理吞噬实验(MOPA)方法,构建并鉴定HL-60效应细胞库、肺炎球菌工作菌种库和补体;在此基础上对5份血清样本进行调理吞噬活性检测。结果 HL-60细胞分化后表面标志表达量CD35为71.78%,CD71为10.97%,活细胞比例为72.96%。13个血清型的肺炎链球菌工作菌种的冻存复活率均高于90%;抗生素抗性与敏感性与预期结果一致;工作稀释度均≥1000。补体的非特异性杀菌率均≤70%。血清样本的杀菌曲线均为标准的S型,平行孔间的差异不超过3倍。结论效应细胞、工作菌种、补体及血清样本的检测结果均符合阿拉巴马大学参考方法的标准要求,成功建立了基于MOPA的功能性抗体检测方法。

重组大肠杆菌外膜蛋白OmpT对小鼠免疫保护作用的研究

为评价大肠杆菌(E.coli)外膜蛋白酶T(OmpT)的免疫原性及对小鼠的免疫效率,本研究将原核重组表达纯化的OmpT蛋白(rOmpT)免疫小鼠,并以灭活的E.coli 308-2全菌疫苗株作为对照组,通过检测其抗体效价、体外调理吞噬作用和细胞因子表达水平以及攻毒试验进行保护效率评价。结果表明rOmpT免疫组在二免后14 d其抗体水平可以达到峰值(1∶64 000),并且其抗血清具有显著促进巨噬细胞对E.coli的吞噬作用;同时,重组蛋白与全菌免疫组均能够显著提高小鼠体内IL-4和IFN-γ的表达。而且重组蛋白免疫组对4个进化种系(Phylogenetic group)的E.coli攻毒的免疫保护率均为60%左右,比全菌免疫组高约10%。研究结果显示rOmpT比全菌灭活E.coli能够诱导小鼠产生更有效免疫保护作用,表明rOmpT可以作为E.coli亚单位疫苗候选蛋白。

猪链球菌-副猪嗜血杆菌二联亚单位疫苗在小鼠的免疫效力分析

本研究旨在开发一种用于防制猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病的新型二联基因工程疫苗,并对其免疫效应进行评价。选择猪链球菌2型蛋白溶血素SLY、HP0197和副猪嗜血杆菌外膜蛋白D15和HPS06257 4种蛋白,重组表达并纯化,添加一定比例的佐剂制成含有不同组分的亚单位疫苗。研究表明该二联亚单位疫苗及各单苗能够引起小鼠良好的体液免疫,并能保护机体分别抵抗致死剂量猪链球菌2型(SS2)和副猪嗜血杆菌(HPS)强毒株的攻击。此外,调理吞噬试验表明疫苗高免血清能够有效杀死细菌,并赋予机体被动抵抗SS2和HPS感染的能力。研究证实制备的猪链球菌-副猪嗜血杆菌二联亚单位疫苗在小鼠具备良好的免疫保护效力。

肺炎球菌调理吞噬杀菌实验方法建立与应用

目的建立肺炎球菌多重调理吞噬杀菌实验,并在此基础上评价肺炎球菌疫苗免疫后效果。方法参照美国阿拉巴马大学多重调理吞噬杀菌实验方法(MOPA),构建7价肺炎球菌结合疫苗血清型的肺炎球菌的工作菌种库和HL-60细胞库,测定工作菌种库抗生素耐药性及稀释度,HL-60分化5~6 d后的表面标志表达量及活性,同时测定标准血清007SP和参考血清09CS的调理杀菌值;在方法建立的基础上,对疫苗免前免后获得的6对血清样本的功能性抗体进行检测。结果工作菌种稀释度均> 300倍;HL-60分化5~6 d的表面标志表达量CD11b> 80%,CD35> 70%,CD71 <15%,活细胞比例> 70%,凋亡细胞比例<21%;补体的非特异杀伤均<30%。标准血清007SP和参考血清09CS的调理杀菌值稳定在质控范围内;疫苗接种后,血清样本的杀菌曲线为S型曲线,并且调理杀菌值保持在较高水平。结论成功建立MOPA实验方法,为肺炎球菌疫苗免疫后的效果评价提供了方法依据。

13价肺炎链球菌疫苗功能抗体检测技术的准确性评估

目的对13价肺炎链球菌疫苗功能抗体检测技术即多型调理吞噬技术(multiplexed opsonophagocytic killing assay,MOPA)进行准确性评估,并为建立该技术的其他实验室提供参考。方法利用建立的MOPA方法对美国食品及药品管理局的16份参考血清盘进行13个血清型(分别为1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型)的调理吞噬试验(opsonophagocytic killing assay,OPKA)滴度检测,将检测值与其各血清型的定值进行比较分析。结果皮尔逊相关系数统计结果显示,各血清型的r值范围为0.90~0.98,平均为0.94。林氏一致性相关系数分析结果显示,13种血清型的r_(c)值范围为0.88~0.98,平均为0.92。对于所检测的13个血清型,处于各型定值上下2倍范围内的数据比率为75%~100%,平均为92%;处于各型定值上下3倍范围内的数据比率为94%~100%,平均为98%。16份参考血清盘的13个血清型的OPA滴度检测结果与其各型定值具有良好的相关性和一致性。结论本研究表明该室建立的MOPA方法具有良好的准确性,可用于肺炎链球菌疫苗的临床免疫原性评价。

肺炎球菌疫苗人血清学评价方法概述

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,简称肺炎球菌)感染是一种引起全球各年龄段人群呼吸系统高发病率及较高死亡率的主要原因之一。目前,为了预防肺炎球菌引起的疾病,已上市2种可预防多种血清型肺炎的多价肺炎球菌疫苗。在评价新研发的肺炎球菌疫苗的保护效果时,疫苗的效力通常取决于接种者疾病发生率的差别。然而,由于疾病的病原学诊断和监测难度大,以及现有疫苗接种在人群中诱导产生的免疫保护力,因此对疾病的保护效果评估存在困难。如果能确定疫苗保护效力的血清学替代指标,将极大地提升新疫苗的研发效率。因此,研究人员开发了针对肺炎球菌疫苗的人血清学评价方法,用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和调理吞噬杀菌试验(opsonophagocytic killing assay,OPKA)方法作为该疫苗保护效力的替代指标,并成为其主要评价方法。现就肺炎球菌疫苗人血清学评价方法ELISA和OPKA作一概述。

肺炎球菌结合疫苗两种免疫效果评价方法的比较分析

目的研究肺炎球菌结合疫苗诱导的功能抗体滴度与总抗体浓度的相关性。方法采用调理吞噬实验(opsonophagocytic assay,OPA)和酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)对13价肺炎球菌结合疫苗免疫后血清样本进行OPA滴度和抗体浓度检测,并就两种检测结果进行比较,分析二者相关性。结果血清型1,3,5,6A,6B,9V,14,18C,19A和23F两种检测结果的相关系数较高,为0.71~0.88。19F和4型的相关系数相对略低,分别为0.66和0.52。结论 OPA法与ELISA法测定的血清抗体效价的相关性较高,二者结果具有良好的一致性。

老年人接种23价肺炎球菌多糖疫苗后特异性功能性抗体水平的监测

目的监测老年人接种23价肺炎球菌多糖疫苗(pneumococcal capsular polysaccharide vaccine-23,PPV-23)后特异性功能性抗体的水平。方法选择沪籍60岁以上健康及结核病痊愈老年人接种PPV-23疫苗,采用肺炎链球菌荚膜多糖多型调理吞噬杀菌试验(multi-specificity opsonophagocyitosis killing assay,MOPA)分别对接种前、接种后1个月、6个月的13种血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F)肺炎球菌的抗体水平进行检测,并对两组人群接种后1个月、6个月的13种血清型OPA抗体水平(GMT)及抗体增长率进行统计学分析。结果大部分老年人接种PPV-23后1个月、6个月13种血清型的OPA抗体GMT均显著高于接种前(P<0.05),接种后6个月结核病痊愈者的1、3型与接种前差异无统计学意义(P>0.05),且接种后1个月与6个月的6A、6B、7F、18C、19F、23F型抗体差异无统计学意义(P>0.05)。接种后1个月13种血清型OPA抗体水平≥2倍增长率均≥60%(除结核病痊愈者1型为37.5%外),且两组人群差异无统计学意义(P>0.05);除结核病痊愈者1、3型外,两组人群各型别OPA抗体水平≥4倍增长率差异无统计学意义(P>0.05)。接种后6个月13种血清型OPA抗体水平≥2倍增长率在45%以上,且除1型外,两组人群间差异无统计学意义(P>0.05);除1型、18C型外,两组人群OPA抗体水平≥4倍增长率差异无统计学意义(P>0.05)。结论健康和结核病痊愈老年人接种PPV-23后可产生针对13种血清型的特异性功能性抗体,且可维持6个月,但结核病痊愈者接种PPV-23后1、3型的OPA抗体水平和持久性明显低于健康老年人。

评价肺炎球菌结合疫苗免疫原性的兔模型的建立

目的 建立一种适用于评价肺炎球菌结合疫苗免疫原性的动物模型.方法 以13价肺炎球菌结合疫苗（PCV13）肌肉注射新西兰兔,3针剂,间隔2周;在不同的时间点采集血清.采用世界卫生组织（WHO）标准定量酶联免疫吸附试验方法（ELISA）检测兔血清中的血清型特异性抗体浓度,采用WHO肺炎链球菌血清学参考实验室的调理吞噬试验方法（OPA）检测兔血清中血清型特异性抗体杀菌功能.结果 兔血清中特异性抗体浓度高低和抗体杀菌功能强弱吻合,并且二者随着时间的消长趋势具有非常好的一致性.结论 兔可用于肺炎球菌结合疫苗PCV13免疫, 并以定量ELISA和OPA检测血清抗体浓度和功能,是评价肺炎球菌结合疫苗免疫原性的合适动物模型.

13价肺炎链球菌结合疫苗中的6A和6B诱导对新发现血清型6C和6D的交叉保护抗体

目的血清型6C和6D是近些年新发现的肺炎链球菌血清型。本研究的目的是考察肺炎链球菌13价结合疫苗PCV13（1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F）里的6A和6B能否诱导对新血清型6C和6D的交叉保护抗体，以及它们对交叉保护抗体的贡献。方法PCV13、6A和6B荚膜多糖分别与CRM197的结合物PCV6A和PCV6B分别于第0天、第14天和第28天以等剂量肌肉注射免疫新西兰兔。免疫前和第35天采血分离血清。采用世界卫生组织（WHO）推荐的定量酶联免疫吸附试验（ELISA）检测兔血清中针对6A、6B、6C和6D荚膜多糖的抗体浓度，并采用WHO肺炎链球菌血清学参考实验室的调理吞噬试验（OPA）检测兔血清抗体针对6A、6B、6C和6D的杀菌功能。结果PCV13能够诱导兔产生针对6A和6B荚膜多糖的抗体，该抗体不仅能够与6C和6D荚膜多糖产生交叉反应，而且能够识别靶细菌6A、6B、6C和6D并激活补体，在激活补体的调理下，靶细菌被分化的HL60细胞吞噬，它们对靶细菌6A、6B、6C的杀菌滴度大致相当，但略高于对6D。PCV6A能够诱导兔产生针对6A荚膜多糖的抗体，该抗体能够与6B、6C和6D荚膜多糖产生交叉反应，它对靶细菌6A、6B和6C的调理吞噬滴度高于对6D。PCV6B能够诱导兔产生针对6B荚膜多糖的抗体，该抗体能够与6A、6C和6D荚膜多糖产生交叉反应，它对靶细菌6A、6B和6C的调理吞噬滴度高于对6D。PCV13、PCV6A和PCV6B免疫后针对6A、6B、6C和6D的荚膜多糖特异性抗体浓度和杀菌滴度均较免疫前有显著性升高（P〈0.01）。结论PCV13能够诱导兔产生针对6A和6B的抗体，它们不仅能够与6C和6D的荚膜多糖产生交叉反应，而且能够交叉保护6C和6D。PCV13中的6A和6B均对产生6C和6D的交叉保护抗体有贡献，其中对6C的贡献多于对6D。

不同基础和加强免疫程序接种13价肺炎球菌结合疫苗的儿童体内抗荚膜多糖抗体量和功能性的比较

不同国家会推荐使用不同的儿童13价肺炎球菌结合疫苗(PCV-13)的免疫程序,美国免疫实施咨询委员会(ACIP)已考虑将基础免疫3剂加1次加强免疫(3p+1)改为基础免疫2剂加1次加强免疫(2p+1)来预防肺炎链球菌疾病。在本文中,作者报告了分别在2p、3p、15月龄时的前加强、18月龄时的后加强免疫后的血清样本通过ELISA和调理吞噬试验(OPA)测定IgG的结果。