调补肺肾三法通过抑制ERK1/2信号通路改善COPD大鼠气道黏液高分泌

目的 探究调补肺肾三法对慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)稳定期大鼠气道黏液高分泌的影响及作用机制。方法 90只大鼠随机分为对照(Control)组、模型(COPD)组、补肺健脾(Bu-Fei Jian-Pi Formula, BJF)组、补肺益肾(Bu-Fei Yi-Shen Formula, BYF)组、益气滋肾(Yi-Qi Zi-Shen Formula, YZF)组、ERK1/2抑制剂(PD98059)组、补肺健脾联合抑制剂(BJF+PD98059)组、补肺益肾联合抑制剂(BYF+PD98059)组和益气滋肾联合抑制剂(YZF+PD98059)组。第1~8周采用香烟烟雾暴露联合细菌反复感染的方法建立COPD大鼠模型,9~16周Control组和COPD组给予生理盐水每只2 mL,BJF组、BYF组和YZF组分别给予对应的调补肺肾三方灌胃,第16周PD98059组、BJF+PD98059组、BYF+PD98059组和YZF+PD98059组给予PD98059腹腔注射7 d。16周结束后取材,检测大鼠肺功能、肺组织形态、肺组织水含量、BALF中炎性细胞计数和血清炎性因子水平。AB-PAS染色和免疫组化法分别检测杯状细胞比例和Muc5AC、Muc5B表达。PCR检测ERK1、ERK2、ENaC、CFTR、AQP5 mRNA表达。Western Blot测定肺组织中ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达。结果 与Control组相比,COPD组大鼠TV、MV、FVC、FEV_(0.1)及FEV_(0.1)/FVC均显著下降(P<0.01);肺病理显示肺泡紊乱,肺泡壁大量断裂,气管壁严重皱缩增厚,周围有大量炎性细胞浸润;肺组织水含量明显升高(P<0.01);BALF中巨噬细胞比例显著降低(P<0.01),中性粒细胞和淋巴细胞比例显著升高(P<0.01);血清炎性因子TNF-α、IL-1β水平显著增高(P<0.05,P<0.01);气道上皮杯状细胞比例和Muc5AC、Muc5B表达水平均显著升高(P<0.01);肺组织ERK1、ERK2、ENaC mRNA表达量均明显升高(P<0.01),CFTR和AQP5 mRNA的表达均明显降低(P<0.01);肺组织P-ERK1/2, ERK1/2表达明显升高(P<0.01);与COPD组相比,各治疗组能不同程度改善上述指标变化(P<0.05,P<0.01),调补肺肾三方联合PD98059组治疗效果优于单一治疗组(P<0.05,P<0.01)。结论 调补肺肾三法通过抑制ERK1/2信号通路改善COPD大鼠气道黏液高分泌。

调补肺肾三法对慢性阻塞性肺疾病稳定期大鼠肠道黏膜屏障的影响

目的:探讨调补肺肾三法对慢性阻塞性肺疾病(COPD)稳定期大鼠肠道黏膜屏障的作用。方法:将SPF级SD大鼠随机分为空白(control)组、COPD模型(model)组、补肺健脾(BJ)组、补肺益肾(BY)组、益气滋肾(ZS)组和茶碱(Am)组。于第1~8周采用香烟烟雾暴露联合脂多糖滴注法制备COPD稳定期大鼠模型,第9~12周分别给予各组大鼠灌胃。观察动物一般情况,HE染色观察肺和结肠组织形态学变化,透射电镜下观察结肠组织超微结构变化,TUNEL法测定结肠组织细胞凋亡率,免疫组化染色检测结肠组织occludin(OCLN)和zonula occludens-1(ZO-1)蛋白表达,ELISA法检测血清二胺氧化酶(DAO)、肠脂肪酸结合蛋白(IFABP)和D-乳酸(D-LA)水平。结果:与control组比较,model组大鼠出现进食减少、消瘦和大便溏薄等症状,支气管黏膜皱襞增多明显,肺泡结构紊乱,形成大的气腔,大量炎症细胞浸润;结肠黏膜结构破坏,大量上皮细胞坏死脱落,杯状细胞明显减少,吸收上皮细胞的微绒毛稀疏、缺损,细胞间隙增宽,细胞间连接装置损坏,结肠细胞凋亡率显著升高(P<0.01),结肠OCLN和ZO-1显著降低(P<0.01),血清DAO、IFABP和D-LA水平显著升高(P<0.01);与model组比较,调补肺肾三方治疗后大鼠上述胃肠道症状均明显改善,支气管和肺泡结构恢复,结肠黏膜结构基本完整,吸收上皮细胞和细胞间紧密连接结构损伤减少,结肠细胞凋亡率均明显降低(P<0.05),结肠OCLN与ZO-1水平均有不同程度升高,其中BJ和ZS组OCLN明显升高(P<0.05或P<0.01),各中药组ZO-1明显升高(P<0.05或P<0.01),BJ和ZS组ZO-1表达较Am组明显升高(P<0.05或P<0.01),ZS组ZO-1较BY组显著升高(P<0.01),血清DAO、IFABP和D-LA水平均显著降低(P<0.01)。结论:调补肺肾三法均能够通过减轻结肠上皮细胞与细胞间紧密连接损伤,降低肠道黏膜屏障通透性,缓解COPD大鼠肠道黏膜屏障损伤,从而保护肠道黏膜屏障完整性。

调补肺肾三法对慢性阻塞性肺疾病稳定期大鼠肺与肠道炎症指标的影响

目的探讨调补肺肾三法对慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)稳定期大鼠肺与肠道IL-6、IL-33和IFN-γ的调控。方法将60只SD大鼠随机分为空白(Control)组、COPD模型(Model)组、补肺健脾(Bufei Jianpi,BJ)组、补肺益肾(Bufei Yishen,BY)组、益气滋肾(Yiqi Zishen,ZS)组和氨茶碱(aminophylline,Am)组。第1-8周,采用香烟烟雾暴露联合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)滴注法制备稳定期COPD大鼠模型,对应给予生理盐水、补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方、氨茶碱灌胃4周,于第13周灌胃周期结束后取材。光镜下观察肺与结肠组织形态学改变,采用免疫组化法(IHC)对肺与结肠组织中白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-33、干扰素(interferon,IFN)-γ蛋白进行定位与半定量观察。结果与Control组相比,Model组大鼠不仅支气管周围与肺泡腔出现大量炎症细胞及炎性渗出,结肠黏膜也出现了大量炎症细胞浸润,肺和结肠IL-6、IL-33和IFN-γ水平明显升高(P<0.05,P<0.01);与Model组相比,各治疗组不仅支气管和肺泡炎症细胞浸润减少,而且结肠黏膜炎症细胞也出现减少,肺与结肠中IL-33和IFN-γ、结肠IL-6水平均明显降低(P<0.05,P<0.01),BY、ZS、Am组肺IL-6水平显著降低(P<0.01)。肺IL-6与结肠IL-6水平呈正相关,肺IL-33与结肠IL-33水平呈正相关,肺IFN-γ和结肠IFN-γ水平呈正相关。结论调补肺肾三法均可以改善慢性阻塞性肺疾病稳定期大鼠肠道功能障碍,其机制可能与抑制肺与结肠中IL-6、IL-33和IFN-γ的释放,降低肺与肠道炎症反应有关。

调补肺肾三法对香烟烟雾提取物和脂多糖刺激A549细胞分泌细胞因子的影响

目的:从调补肺肾三法对香烟烟雾提取物(CSE)和脂多糖(LPS)刺激A549分泌细胞因子变化的影响,揭示调补肺肾三法治疗COPD分子机制。方法:CSE和LPS及两者联合(LC)刺激肺泡上皮细胞A549,每种刺激物下分为正常组(20%正常大鼠血清)、刺激物组(20%正常大鼠血清和5%CSE或75pg/mL LPS,或5%CSE和75pg/mL LPS)、补肺益肾组(BYFS)、补肺健脾组(BFJP)和益气滋肾组(YQZS)(20%相应方药大鼠含药血清和5%CSE或75pg/mL LPS,或5%CSE和75pg/mL LPS),ELISA法检测细胞因子,应用网络工具分析细胞因子的转录因子。结果:与正常组比较,CSE、LPS和LC组A549分泌IL-3和TGF-β减少(P<0.01);CSE组分泌MMP-9增加,分泌IL-8减少(P<0.05);LPS组分泌TIMP-1增加(P<0.05),LC组分泌TNF-α和MMP-9减少(P<0.01,P<0.05)。与CSE组比较,BFYS组分泌IL-1β和PPAP2B增加(P<0.01,P<0.05);BFJP组分泌TNF-α减少(P<0.05),IL-1β和PPAP2B增加(P<0.01,P<0.05);YQZS组分泌L1β增加(P<0.01)。与LPS组比较,BFYS组分泌IL-1β、MMP-9(P<0.01)和PPAP2B增加(P<0.05),分泌TIMP-1、PPAP2B和TNF-α减少(P<0.05);BFJP组分泌TIMP-1和TNF-α减少(P<0.01),分泌IL-1β和SOD增加(P<0.05);YQZS组分泌TIMP-1和TNF-α减少(P<0.05,P<0.01),IL-3、MMP-9和IL-1β分泌增加(P<0.05)。与LC组比较,BFYS组分泌MMP-9、IL-3、SOD、IL-1β、TNF-α、CD36分泌增加(P<0.05);BFJP组分泌MMP9、TGF-β、SOD、IL-1β分泌增加(P<0.05);YQZS组分泌MMP-9、IL-3、SOD、TNF-α、TGF-β增加(P<0.05),3个用药组分泌的TIMP-1皆减少(P<0.01)。结论:CSE和LPS对A549分泌细胞因子影响不同。3个调补肺肾方药对CSE和LPS刺激下分泌细胞因子和转录因子均有一定调控作用,补肺益肾中药在CSE刺激下纠正细胞因子分泌作用较好,益气滋肾中药对LPS与CSE联合状态下调节效果较好。

调补肺肾三法对香烟烟雾提取物和脂多糖刺激单核巨噬细胞THP-1分泌细胞因子的影响

目的探讨调补肺肾三法治疗慢性阻塞性肺疾病的分子机理。方法用香烟烟雾提取物(CSE)和脂多糖(LPS)及两者联合(LC)体外刺激单核巨噬细胞THP-1,每种刺激物下分为正常组(加入20%正常大鼠血清)、刺激物组(加入20%正常大鼠血清和5%CSE,或75pg/mlLPS,或5%CSE和75pg/mlLPS)、补肺益肾组、补肺健脾组和益气滋肾组(加20%相应方药大鼠含药血清和5%CSE,或75pg/mlLPS,或5%CSE和75pg/mlLPS),检测各组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-3(IL-3)、巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、转化生长因子-β(TGF-β)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、CD36、磷脂酸磷酸酶2B(PPAP2B),应用网络工具分析细胞因子的转录因子。结果与正常组比较,CSE组、LPS组和LC组分泌MMP-9增加,分泌TNF-α和PPAP2B减少;CSE组分泌TIMP-1减少,LPS组分泌TGF-β增加,LC组GM-CSF分泌增加(P<0.05或P<0.01)。3个复方对细胞分泌的各因子调节明显不同(P<0.05或P<0.01),其中补益肺肾方在各条件下,所调节分泌的因子和涉及转录因子较为广泛。结论 CSE和LPS对THP-1分泌细胞因子影响不同,调补肺肾三法在一定程度上都对CSE和LPS刺激下分泌细胞因子有调控作用,补益肺肾方药作用最明显而广泛,补肺健脾方次之。