Lyz2+单核-巨噬细胞在多囊卵巢综合征小鼠子宫中的谱系示踪

目的在骨髓来源巨噬细胞谱系示踪小鼠上建立多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)模型,通过谱系示踪方法揭示巨噬细胞在PCOS小鼠子宫中的分布特点。方法利用Cre/LoxP系统构建骨髓来源巨噬细胞谱系示踪小鼠,分别构建Td-tomato^(flox/flox)小鼠和Lyz2^(Cre)工具小鼠,使两者进行交配,得到Lyz2^(Cre)Tdtomato^(flox/flox)小鼠,其骨髓来源单核-巨噬细胞均被标记上红色荧光蛋白(Td-tomato),再通过来曲唑联合高脂饲料构建PCOS小鼠模型,通过免疫荧光多标结合激光共聚焦共定位方法检测PCOS小鼠子宫中巨噬细胞的分布及数量。结果成功构建了骨髓来源单核-巨噬细胞谱系示踪小鼠(Lyz2^(Cre)Td-tomato^(flox/flox)),并在谱系示踪小鼠上成功构建了PCOS小鼠模型。PCOS小鼠子宫的HE染色结果显示结构异常;免疫荧光多重标记检测发现,在PCOS小鼠子宫中巨噬细胞分布在子宫外膜、肌层、内膜,且M2型巨噬细胞数量增多(P<0.05)。结论本研究构建了肥胖型PCOS小鼠模型,发现骨髓来源的M2型巨噬细胞在PCOS小鼠子宫中增多。

基因谱系示踪技术揭示小鼠Tbx18^+心脏祖细胞向心系细胞分化的潜能

心脏祖细胞(cardiac progenitor cells,CPCs)的研究对阐明先天性心脏病的机制及治疗心血管疾病具有重要意义.哺乳动物的心脏组织由多种不同CPCs分化形成.转录因子Tbx18在发育中的心外膜中表达,对心脏的发育形成起重要的调节作用.为了在组织及活体细胞水平检测和阐明Tbx18+CPC的分化潜能,应用Cre-LoxP系统建立Tbx18+CPCs基因命运谱系示踪模型:Tbx18-Cre/Rosa26R-EYFP和Tbx18-Cre/Rosa26R-LacZ双杂合基因敲入小鼠.该双杂合基因敲入小鼠通过Cre的表达能有效地示踪Tbx18+细胞在胚胎和成年小鼠中的分化命运.Tbx18-Cre/Rosa26R-EYFP双杂合小鼠心脏能非常容易地利用流式细胞分选系统(FACS)分离出YFP+细胞,也可在倒置共聚焦显微镜下观察.应用X-gal染色分析其表达模式,揭示Tbx18命运谱系参与心房肌、室间隔、心室肌、冠状动脉、瓣膜等的形成.应用免疫荧光技术初步揭示Tbx18+CPCs向心脏肌钙蛋白T(cTNT)阳性心肌细胞和平滑肌肌球蛋白重链11(MYH11)阳性血管平滑肌细胞分化的潜能.心脏是一个由多种肌肉和非肌肉组织细胞构成的复杂器官.推测Tbx18可能在心脏祖细胞向肌源性细胞分化的信号通路中起重要调节作用.在上述研究中应用基因谱系示踪技术,验证Tbx18可作为一类CPCs的标志,为更深入揭示心脏祖细胞向心系细胞的分化潜能打下基础.

基因谱系示踪揭示小鼠Tbx18^+肾脏间质祖细胞分化为输尿管平滑肌

本文旨在研究Tbx18+肾脏间质祖细胞分化为输尿管平滑肌细胞的命运及转录因子Tbx18在小鼠输尿管平滑肌发育形成中起到的作用.实验建立Tbx18:Cre/R26REYFP和Tbx18:Cre/R26RLacZ两种谱系示踪系统和Tbx18:Cre/Cre敲除模型.该示踪模型通过cre重组酶的表达能有效地示踪Tbx18+肾脏间质祖细胞在泌尿系统的发育命运.通过免疫荧光染色和X-gal染色,同时发现Tbx18+肾脏间质祖细胞可分化为输尿管平滑肌细胞,但不分化为输尿管移行上皮细胞.在Tbx18:Cre/Cre基因突变模型中,泌尿系统出现明显的肾积水和输尿管积水,肾盏、肾盂扩张,输尿管明显缩短和扩张.实验结果揭示,Tbx18+肾脏间质祖细胞可以分化为输尿管平滑肌细胞,且转录因子Tbx18在哺乳动物输尿管平滑肌的发育中起到重要的作用.

细胞谱系示踪技术

细胞谱系示踪(cell lineage tracing)是指利用各种方式标记细胞,并对包括其后代所有细胞的增殖、分化以及迁移等活动进行追踪观察。自20世纪以来,谱系示踪技术为研究器官发育、组织损伤修复以及单细胞的分化命运提供了重要的手段。近些年,随着基因工程技术的飞速发展,细胞谱系示踪技术也有所突破,尤其是诱导性重组酶Cre/loxp系统的应用,极大地拓宽了细胞谱系示踪技术的应用范围。本文将结合细胞谱系示踪技术在多种研究中的应用,对该技术的原理、特点以及最新进展做一综述。

遗传谱系示踪技术揭示小鼠胚胎前体心外膜向心外膜转化过程

心外膜的形成是胚胎心脏发育的关键生理过程之一。利用遗传谱系示踪技术示踪观察前体心外膜向心外膜细胞转化过程,具有重要的科学研究价值。本研究拟利用Tbx18＋前体/心外膜祖细胞遗传谱系示踪模型,揭示胚胎心外膜的起源及前体心外膜向心外膜转化的过程。利用整胚和切片原位杂交技术揭示,Tbx18 mRNA特异性表达于胚龄（E）9.5 d小鼠胚胎前体心外膜;故Tbx18是前体心外膜的特异性标记基因。利用整胚X-Gal染色,揭示报告基因Lacz在E9.5 d遗传谱系示踪模型鼠胚前体心外膜中大量表达,此时报告基因从前体心外膜逐渐迁移并开始少量表达于心外膜。Lacz在E10~E10.5 d双杂合鼠胚前体心外膜中表达逐渐减少,而在心外膜组织中逐渐增多;在E11.5 d,报告基因在前体心外膜中表达基本消失,而在心外膜组织中大量表达。切片进行XGal染色也揭示,报告基因Lacz定位于早期胚胎前体心外膜及心外膜。免疫荧光染色证实,早期胚胎心外膜细胞呈现未分化的祖细胞状态。通过报告基因的表达变化模式揭示,胚胎心外膜的形成经历了启动、转化、完成3个阶段;E9.5~11.5 d左右这个时间段发生的前体心外膜向心外膜转化,可能是心外膜形成的主要来源和形式。

谱系示踪技术揭示Tbx18^+肾祖细胞分化为脂肪细胞的潜能

转录因子Tbx18在泌尿系发育中发挥重要作用。利用遗传谱系示踪模型,揭示了Tbx18^+肾祖细胞具有向多种肾系细胞分化的潜能。但尚无文献报道其是否具有向脂肪细胞分化的潜能。本研究通过对Tbx18Cre/Rosa26^(LacZ)双杂合小鼠泌尿系组织进行整体X-gal染色发现,肾包膜、输尿管及肾周脂肪组织能特异性表达β-gal蛋白,说明肾包膜、输尿管及肾周脂肪组织可能来源于Tbx18+祖细胞。对Tbx18Cre/Rosa26^(EYFP)双杂合小鼠泌尿系组织进行免疫荧光染色,发现部分脂滴相关蛋白^+(perilipin)脂肪细胞能表达标记蛋白EYFP,说明部分泌尿系脂肪细胞来源于Tbx18^+祖细胞。本研究揭示了Tbx18^+祖细胞具有分化为脂肪细胞的潜能,进一步证实了Tbx18^+肾祖细胞的多分化潜能。结合本研究结果,若进一步研究肾损伤时,来源于Tbx18^+祖细胞的泌尿系脂肪细胞是否进一步增多,将会为肾损伤的再生修复提供一些思路和启发。

细胞谱系示踪技术在肝脏纤维化上皮-间质转化研究中的应用

肝脏纤维化是多种慢性肝脏损伤共同的病理过程.通过免疫组织化学技术研究人和动物样本证实,在慢性损伤肝脏纤维化过程中,一些肝脏细胞可发生上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)促进肝脏纤维化.然而免疫组织化学技术存在许多技术上的缺陷,导致肝脏纤维化过程中存在EMT的观点饱受质疑.细胞谱系示踪技术为研究器官发育、组织损伤修复以及单细胞的分化命运提供了重要的手段.近些年,随着基因工程技术的飞速发展,细胞谱系示踪技术也有所突破,尤其是诱导性重组酶Cre/loxp系统的应用,极大地拓宽了细胞谱系示踪技术的应用范围.目前,该技术越来越多的应用于研究肝脏纤维化过程中的EMT.本文将近来来细胞谱系示踪技术在判断肝脏纤维化过程中是否发生EMT的实验研究作一综述.

基因谱系示踪揭示Tbx18^+祖细胞的多分化潜能

为探讨Tbx18+祖细胞在小鼠生长发育过程中的多分化潜能及分化的组织类型,本工作建立了Tbx18:Cre/Rosa26RLac Z谱系示踪小鼠.该示踪小鼠基于Cre-LoxP系统,能够准确及有效地示踪Tbx18+祖细胞的分化命运,通过整体胚胎及组织X-gal染色,检测分析报告基因LacZ在其中的表达情况.结果显示,在Tbx18:Cre/Rosa26RLac Z双杂合小鼠胚胎发育早期,报告基因LacZ主要在脊柱、四肢及心外膜表达;而在胚胎发育晚期则分别表达于皮肤、毛囊、肾脏、输尿管、膀胱、睾丸、输精管、椎间盘、肋软骨、心耳、心肌、冠状动脉.结果阐明,Tbx18+祖细胞在小鼠生长发育过程中具有强大的多器官及组织分化潜能,包括分化形成表皮系统,泌尿生殖系统,骨骼系统,心血管系统,并在其生长发育中发挥重要作用.

Prrx1+牙周膜干细胞在牙移动过程中的谱系示踪

目的·通过Cre/loxP重组酶系统研究牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)中配对相关同源基因1(paired related homeobox 1,Prrx1)阳性细胞谱系(Prrx1+细胞谱系)在小鼠牙移动过程中的动态分布。方法·利用Cre/loxP重组酶系统,将诱导型Prrx1-Cre^(ERT2)小鼠与R26^(tdTomato)荧光标记小鼠交配繁殖,并通过PCR对其子代小鼠进行基因型鉴定。取8只子代小鼠,向其腹腔注射他莫昔芬(tamoxifen,TA),以标记PDLSCs中的Prrx1+细胞谱系(即tdTomato^(+)细胞)。于小鼠上颌左侧安置加力装置[即正畸牙移动(orthodontics tooth movement,OTM)侧],右侧未加力即为对照侧,以构建小鼠OTM模型。分别于牙移动第3日(OTM 3 d)、第7日(OTM 7 d)时处死小鼠,收集其双侧上颌磨牙及周围牙周组织,经脱钙后行包埋及冰冻切片处理。采用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,H-E染色)观察张力区和压力区牙周膜的改变,并利用免疫荧光染色观察Prrx1+细胞谱系在张力区及压力区的动态分布。结果·经PCR鉴定,子代小鼠基因型为Prrx1-Cre^(ERT2);R26^(tdTomato)。随着加力装置作用的增加,OTM 7 d小鼠的牙移动距离[(87.44±4.02)μm]较OTM 3 d小鼠[(42.81±5.04)μm]明显增加,提示小鼠OTM模型构建成功。H-E染色结果显示:OTM 3 d时小鼠OTM侧压力区的牙周膜被压缩、间隙变窄,而OTM 7 d时OTM侧牙周膜宽度逐渐恢复;OTM 3 d时OTM侧张力区的牙周膜被拉伸,而OTM 7 d较OTM 3 d时牙周膜排列更规则。免疫荧光染色结果显示:OTM 3 d时OTM侧压力区牙周膜中tdTomato^(+)细胞数量较对照侧减少,OTM 7 d时OTM侧压力区tdTomato^(+)细胞数量较对照侧增加(均P<0.05);OTM 3 d及OTM 7 d时,OTM侧张力区tdTomato^(+)细胞数量较对照侧均有增加(均P<0.05)。结论·成功构建了Prrx1-Cre^(ERT2);R26^(tdTomato)小鼠的OTM模型,并初步证实了Prrx1+细胞谱系参与OTM过程中的牙周改建。

纤毛转运蛋白140谱系示踪小鼠模型构建

目的:研究纤毛转运蛋白140(intraflagellar transport protein 140,IFT140)阳性细胞在小鼠生长发育过程中的动态分布与转归。方法:利用Cre/loxP系统构建IFT140谱系示踪小鼠动物模型,将构建的IFT140-CreER小鼠与R26RtdTomato小鼠进行交配繁殖,获得基因型为IFT140-CreER;R26RtdTomato小鼠。用他莫昔芬(tamoxifen)腹腔注射诱导Cre重组酶表达,并在特定的时间点观察IFT140阳性细胞的分布、分化及转归规律。结果:聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)验证小鼠基因型符合IFT140-CreER;R26RtdTomato。结果显示,阳性细胞在纤毛富集的组织中信号清晰,模型构建成功;骨组织中的IFT140阳性细胞首先出现在骨髓中,随着骨骼发育分布于骨小梁及骨皮质表面。结论:本研究成功构建了谱系示踪小鼠模型,为观察IFT140在小鼠体内重要器官尤其是骨组织发育中的作用,提供实验动物模型。

基于Cre/Loxp重组酶系统的谱系示踪技术在成骨改建研究中的应用进展

细胞谱系示踪技术是研究干细胞特性的重要工具,基于Cre/Loxp重组酶系统的谱系示踪技术是示踪方法的一大突破,组成性重组酶系统实现了报告基因的组织特异性,诱导性重组酶系统在此基础上实现了报告基因表达时间的可控性。研究成骨改建机制涉及成骨细胞系命运,对骨改建研究、组织工程学应用是有重要意义。本文综述了基于Cre/Loxp重组酶系统的谱系示踪技术在研究成骨系细胞分化、来源、转归及其在发育和修复中的功能等方面的应用,并探讨其适用范围、优势和不足。

谱系示踪技术在乳腺上皮增殖、转化及肿瘤转移过程中应用

乳腺上皮细胞在哺乳动物中起合成和分泌乳汁的功能,同时介导乳腺肿瘤的发生,但乳腺癌转移过程存在很大争议。研究利用遗传谱系示踪技术追踪乳腺上皮细胞,示踪其增殖、转化形成乳腺肿瘤细胞,并迁移形成肺转移灶的过程。利用小鼠为实验模型,采用KitCreER转基因小鼠与报告基因小鼠R26-Ai47结合靶向示踪乳腺上皮细胞,然后结合乳腺原位肿瘤小鼠模型MMTV-PyMT形成3基因型,观察在青春期和老年期小鼠乳腺肿瘤细胞向肺转移的情况。结果:KitCreER可特异性标记乳腺管腔上皮细胞,可发生增殖转化贡献形成乳腺肿瘤细胞,肿瘤细胞在青春期不发生肺转移灶但在老年期会形成明显的肺转移灶。从分子遗传学角度解析乳腺上皮细胞在乳腺癌中的作用特点。

谱系示踪技术在肝再生中的应用研究进展

目的了解谱系示踪技术的最新发展现状及它在肝再生机制研究中的应用情况。方法检索国内外关于谱系示踪技术在肝再生中应用相关研究的文献并进行综述。结果目前已发展了较多可靠且先进的谱系示踪技术,如单细胞RNA测序技术、DNA条形码技术等,为深入了解肝再生机制提供了强大的工具,它们在鉴定肝再生细胞来源、对肝再生区域鉴定及研究肝损伤后再生机制中取得了一定的进展;通过谱系示踪技术有助于了解不同类型肝细胞在肝脏结构中的位置和功能,揭示了不同亚群肝细胞的再生潜力和贡献,而且通过该技术支持了在慢性肝损伤条件下肝细胞和胆管细胞之间的转分化现象,有助于了解在肝再生中扮演关键角色的Wnt/β-catenin、Hippo/Yes相关蛋白和Notch信号通路的具体作用。结论尽管谱系示踪技术已在肝再生研究中取得了长足的进展,但由于肝再生是一个复杂而重要的生理过程,而且该技术仍存在不足,如面临标志特异性的挑战、研究周期较长且成本较高、由动物模型转化到人类临床应用时可能存在局限性、不能解决所有关于肝再生机制的问题以及伦理和法律问题,因此仍需更深入更全面的研究,以揭示肝再生机制的更多细节。

谱系示踪探索肝实质细胞再生修复机制的研究进展

肝实质细胞是肝脏承担代谢、解毒等重要功能的细胞类型,由于其具有很强的增殖能力使得肝脏损伤修复过程中肝实质细胞、胆管细胞和肝脏干/祖细胞对新生肝实质细胞的贡献程度成为了有争议的问题。谱系示踪技术是近十余年兴起的、探索细胞起源的新方法,通过对表达某一基因的细胞及其后代细胞进行标记可以实现对特定类型细胞及其子代细胞进行示踪。现对利用该技术探索肝实质细胞起源与贡献的文献进行综述,在肝脏稳态和急性损伤后,约98%的新生肝实质细胞来源于原有肝实质细胞,在肝实质细胞增殖被抑制等严重肝损伤的情况下,胆管细胞(主要是其中的肝脏干/祖细胞)才成为肝实质细胞的主要来源,且其贡献率随时间延长逐渐增加。

巨噬细胞示踪小鼠的构建及在PCOS研究中的应用

目的构建骨髓来源单核-巨噬细胞谱系示踪小鼠,并探究其在多囊卵巢综合征(PCOS)卵巢免疫机制研究中的应用。方法基于Cre/LoxP系统构建巨噬细胞荧光示踪小鼠模型,将Lyz2^(Cre)工具鼠与R26-CAG-LSL-tdTomato示踪小鼠交配,通过PCR鉴定,筛选得到Lyz2^(Cre);Td-tomatoflox/flox小鼠;收取各器官组织制作冰冻切片,通过激光共聚焦成像,检测Lyz2^(Cre);Td-tomatoflox/flox小鼠中巨噬细胞的示踪效果;并对示踪小鼠进行高脂喂养联合来曲唑灌胃,构建肥胖型PCOS模型。通过功能学及组织病理学方法评估PCOS模型构建是否成功;通过免疫荧光多重标记结合激光共聚焦成像检测Td-tomato示踪的巨噬细胞在生理性卵巢及PCOS卵巢中的分布及分型。结果在肝、肺、脾脏、卵巢及子宫等巨噬细胞丰富的组织中可见清晰的Td-tomato荧光信号与巨噬细胞分布相符;PCOS模型组卵巢呈多囊样改变,且小鼠体质量、卵巢湿重与血糖均升高(P均<0.05);免疫荧光多标检测结果显示,与对照组相比,PCOS组卵巢中骨髓来源巨噬细胞增多(P<0.05)并浸入囊状卵泡腔中,且M1型占比升高(P<0.05)。结论成功构建了巨噬细胞谱系示踪小鼠(Lyz2^(Cre);Td-tomatoflox/flox),PCOS小鼠卵巢骨髓来源巨噬细胞呈现M1型,可能是导致PCOS卵巢免疫微环境失衡的关键因素。

CREST:高通量单细胞谱系示踪新工具

细胞谱系是指发育过程中产生的细胞类型及其先后代关系.高等动物的细胞类型多样,在发育、再生、癌变等不同的生命过程中,细胞谱系有不同的组成和变化[1].研究发育谱系能帮助我们厘清各类细胞所处的发育阶段与功能,对理解相关的发育疾病机制、再生修复机理有着重要的作用.

神经胶质瘤相关癌基因锌指蛋白1遗传谱系示踪小鼠在肝纤维化研究中的应用

目的探索神经胶质瘤相关癌基因锌指蛋白1(glioma-associated oncogene homolog 1,Gli1)遗传谱系示踪小鼠在肝纤维化研究中的应用。方法将ROSA26td Tomato(tdTomato)小鼠及Gli1-CreERt2(Gli1)小鼠进行繁育保种及交配,经PCR基因型鉴定获得Gli1-CreERt2;tdTomato目标小鼠。利用CCl4制备肝纤维化小鼠模型。取肝脏组织,制作石蜡切片进行HE和Masson染色。制作冰冻切片,于荧光显微镜下观察红色荧光蛋白tdTomato的表达。结果获得理想数量Gli1-CreERt2;tdTomato目标小鼠。繁殖性能检测发现,亲代与各子代小鼠的繁殖性能无显著性差异(P>0.05)。HE及Masson染色结果发现,CCl4诱导的纤维化模型组假小叶形成。荧光显微镜观察发现,模型组中红色荧光强度明显高于正常对照组。结论 Gli1遗传谱系示踪小鼠可以通过对Gli1阳性细胞的示踪,实现肝纤维化发病过程中纤维组织来源细胞的检测、转化及参与肝纤维的发病机理研究。

细胞示踪技术研究概述

从胚胎发育开始,动物细胞就在不断地迁移、分化,以实现协调、稳定的生命活动。细胞示踪技术在细胞或亚细胞水平上,通过观察示踪细胞的活动,对动物活体实现动态观察。该技术对于研究细胞起源、了解组织器官发育过程以及探讨疾病的发生和发展机制都具有重要的意义,在医学、组织工程和发育生物学领域有着广泛的应用。本文对当前细胞示踪技术涉及的主要示踪标记物、标记方式和成像技术等的研究进展进行概述。

体内示踪技术在造血干细胞分化机制中的应用及研究进展

造血干细胞(HSC)位于造血系统层级的顶端,并具有分化为不同潜能造血祖细胞(HPC)和各系成熟造血细胞的能力。目前,对于造血干祖细胞在稳态与应激状态下如何分化形成完整造血系统的过程并不十分清楚。体内示踪技术通过标记并追踪单个细胞及其子代细胞的分化路径为HSC的研究提供了强大的技术体系。传统的谱系示踪主要基于影像技术,利用荧光染料及核酸类似物等实现细胞的标记和追踪。如今,多种新型示踪技术的产生以及DNA测序技术的联合使用在单细胞水平上为细胞状态、细胞命运以及细胞谱系的研究打开了新的视角。本文将对新型谱系示踪技术进行介绍和讨论,并对这些技术在造血系统谱系分化中的应用作一综述。

Gli1阳性间充质干细胞在牙及牙周组织中的分布及作用

Hedgehog(Hh)信号通路在哺乳动物的组织发育和器官形成中发挥重要作用。Gli1是Hh信号通路中重要的转录因子之一,并已被证实为间充质干细胞(MSCs)可靠的体内标记物。Gli1阳性MSCs具有自我更新能力和多向分化潜能,在牙及牙周组织中可分化为多种功能细胞,包括成牙本质细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞和成骨细胞,参与组织的生长发育与稳态维持。本文对目前关于Gli1阳性MSCs在牙及牙周组织的分布与作用的研究进展作一综述,以期为牙及牙周组织的再生治疗提供新思路。