谷氨酰半胱氨酸连接酶活性在系统性红斑狼疮中的变化及意义

目的探讨SLE人群和正常对照组外周血淋巴细胞中谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)活性的差异。方法收集30例活动期的SLE病例与30名正常对照,利用密度梯度离心法提取外周血淋巴细胞,酶法测定外周血淋巴细胞中GCL的活性水平。同时分析合并和未合并狼疮肾炎的SLE组之间GCL活性水平的差异。结果与对照组(383.27±18.68mmol/min/mg蛋白浓度)相比较,SLE组(266.10±13.31mmol/min/mg蛋白浓度)GCL活性水平明显下降(P<0.0001);与未合并狼疮肾炎(LN)的SLE组(303.25±18.47mmol/min/mg蛋白浓度)相比较,合并LN的SLE患者GCL平均活性水平(229.64±17.82mmol/min/mg蛋白浓度)显著减低(P<0.009)。结论 SLE患者GCL活性异常,可能在系统性红斑狼疮组发病和病情进展中起一定作用。

人γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因E-box元件功能初步分析

目的:探讨人支气管上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因上游调控序列E-box元件的功能。方法:利用PCR法克隆人GCLC基因上游调控序列,PCR重叠延伸法对2个E-box元件分别和同时进行定点突变。扩增获得的突变体片段克隆入PMD18-T载体,DNA测序鉴定后,亚克隆入野生型GCLC-Luc荧光素酶报道载体。将3个突变体质粒和野生型质粒转染人肺泡上皮细胞A549和人支气管上皮细胞16HBE,检测转染后细胞荧光素酶活性值。结果:测序结果证实,成功将E-box1CACGGG突变为AGCGGG;E-box2CACGTG突变为CACGGA。GCLC-Luc、GCLC-mEbox1-Luc(突变E-box1)、GCLC-mEbox2-Luc(突变E-box2)、GCLC-mEbox12-Luc(突变E-box1和E-box2)转染A549细胞后荧光素酶活性值分别为(5197852±132206)U、(5455692±127431)U、(5315722±244197)U、(5174303±183179)U,转染16HBE细胞后荧光素酶活性值分别为(141157±18907)U、(126454±23724)U、(137315±22179)U、(132441±28970)U。经过统计学分析,各组荧光酶活性没有显著差别,均P>0.05。结论:E-box元件不参与基础状态下A549细胞和16HBE细胞GCLC基因转录调控。

谷氨酰-半胱氨酸连接酶催化亚基C-129T和修饰亚基G-23T多态性与冠心病的关系

目的探讨谷氨酰-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)C-129T 多态性和修饰亚基(GCLM)G-23T 多态性与冠心病遗传易感性的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态方法,检测212例冠心病与218例对照的 GCLC C-129T 和 GCLM G-23T 基因型分布及差异。结果冠心病组中 GCLC-129T 等位基因频率显著高于对照组(P<0.01),GCLC-129T 的冠心病发病风险是-129C 的2.38倍(95% CI:1.25～4.54)。与 GCLC-129CC 基因型相比,GCLC-129CT 基因型的冠心病发病风险显著增加至2.14倍(95% CI:1.08～4.24,P<0.05),GCLC-129T 等位基因携带者(CT、TT 基因型)患冠心病的风险显著增加至2.28倍(95% CI:1.16～4.49,P<0.05)。冠心病组中GCLM-23T 等位基因频率显著低于对照组(P<0.01),GCLM-23T 的冠心病发病风险是-23G 的0.59倍(95% CI:0.42～0.82)。与 GCLM-23GG 基因型相比,GT、TT 基因型和-23T 等位基因携带者(GT、TT 基因型)的冠心病发病风险分别为0.71倍(95% CI:0.47～1.08,P>0.05)、0.18倍(95%CI:0.06～0.55,P<0.01)和0.61倍(95% CI:0.42～0.92,P<0.05)。结论 GCLC C-129T 多态性可能是冠心病的一个遗传易感因素,而 GCLM G-23T 多态性可能是冠心病的一个遗传保护因素。

体重指数与谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基基因多态性的交互作用对女性乳腺癌风险的影响

目的 探讨谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基（GCLC）rs17883901多态性位点对BMI与乳腺癌关联的影响.方法 于2008年10月至2010年6月对中山大学3所附属医院新诊断的839例乳腺癌患者（病例组）在接受治疗前及同时期863名年龄频数匹配的对照（对照组）进行问卷调查和收集血样；采用基质辅助激光解吸-飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）,在Sequenom平台检测rs17883901位点基因型；采用非条件logistic回归分析计算BMI和GCLC与乳腺癌关联的OR值及其95％CI.结果 （1）病例组和对照组接受调查时当前的BMI、20岁时的BMI和GCLCrs17883901位点分布的差异均无统计学意义（P=0.44、0.52和0.47）；（2）未发现当前的BMI与绝经前及绝经后乳腺癌风险相关,20岁时BMI为18.5～22.9 kg/m2可降低绝经前乳腺癌风险（OR=0.69,95％CI：0.48～1.00）,而未发现其与绝经后乳腺癌风险相关；（3）在GCLC rs17883901位点突变型CT/TT人群中,当前的BMI≥25 kg/m2显著增加乳腺癌风险（OR=1.91,95％CI：1.09～ 3.36）,而20岁时BMI为18.5 ～ 22.9 kg/m2与降低乳腺癌风险有关（OR=0.56,95％CI：0.31 ～ 0.99）.当前的BMI与GCLC基因多态性对乳腺癌发生风险存在交互作用（P=0.043）,而20岁时的BMI与GCLC交互项无统计学意义（P=0.15）.结论 20岁时增加BMI可能是绝经前乳腺癌的保护因素；GCLCrs17883901位点本身与乳腺癌发生风险无显著关联,但其变异基因型可使当前的肥胖状态（BMI≥25 kg/m2）显著增加乳腺癌发生风险.

谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚单位基因甲基化而非多态性与慢性阻塞性肺疾病相关

目的 探讨谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚单位（GCLC）基因多态性和甲基化与慢性阻塞性肺疾病（COPD）易感的相关性.方法 收集166例COPD患者为COPD组,同期与上述COPD患者相似的非COPD人群166例为对照组.使用基因测序法检测两组人群GCLC基因启动子区域的单核苷酸多态性（SNP）,分析各SNP位点的单倍体型与COPD发病的关系.使用甲基化DNA免疫共沉淀芯片（MeDIP-chip）检测两组人群GCLC启动子区域甲基化水平,进行两组人群GCLC mRNA表达水平和血谷胱甘肽（GSH）浓度的比较.结果 通过直接测序法在GCLC启动子区域鉴定出12个SNP,其中4个SNP,即-2137MT、-129C/T、＋27591C/G和＋37764MG在COPD组和对照组人群中的发生率超过10％.-129C/T与-2137MT、＋27591C/G、＋37764MG均处于连锁不平衡.COPD组和对照组人群上述4个SNP的等位基因频率和基因型频率差异均无统计学意义（均P＞0.05）.MeDIP-chip检测显示COPD组GCLC启动子区域甲基化水平明显高于对照组（P＜0.001）.COPD组肺组织标本GCLC mRNA表达水平明显低于对照组（3.71±0.48比5.16±0.39,P＜0.05）,血谷胱甘肽（GSH）水平也低于对照组[109.72±32.38）mg/L比（179.87±46.23） mg/L,P＜0.05].结论 中国人群GCLC启动子区域甲基化而非GCLC基因多态性与COPD相关.

激活转录因子4协同核因子相关因子-2调控γ谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基的表达对支气管哮喘豚鼠的影响

支气管哮喘（简称哮喘）是一种气道慢性炎症性疾病。氧化应激在诱导气道炎症及其发展中起关键作用。核因子相关因子-2（NF-E2-relatedfactor2，Nrf2）是一种对氧化还原敏感的转录因子，调节肺部几乎所有相关抗氧化基因，如1．谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基（γglutamyleysteinesynthetasecatalyticsubunitγGCSc）。

谷氨酰半胱氨酸连接酶调节基因多态性与慢性阻塞性肺疾病易感性的关系

目的探讨谷氨酰半胱氨酸连接酶调节(GCLM)基因多态性与血浆γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γGCS)活性及慢性阻塞性肺疾病(COPD)易感性的关系。方法应用聚合酶链反应(PCR)及限制性片段长度多态性分析(RFLP)方法检测106例稳定期吸烟的COPD患者(COPD组)、124名健康吸烟者(C组)及132名健康不吸烟者(H组)GCLM基因-588C/T和-23G/T多态性位点基因型,并用双酶法检测血浆γGCS活性。结果-588CC与-23GG、-588CT与-23GT、-588TT与-23TT基因型在个体间分布一致。COPD组-588位点CC基因型和C等位基因频率(62.3%、79.2%)显著低于C组(84.7%、91.9%)和H组(78.8%、89.0%,P均<0.01)。吸烟者-588T等位基因相对于C等位基因患COPD的比值比(OR值)为3.0,95%可信区间为1.7～5.3。C组[(282±58)U/mg·prot]和COPD组[(224±54)U/mg·prot]血浆γGCS活性显著高于H组[(157±26)U/mg·prot,P<0.01],其中C组高于COPD组(P<0.01)。H组-588CC与CT/TTγGCS活性比较差异无统计学意义[(158±27)、(153±25)U/mg·prot,P>0.05],而C组[(292±54)、(225±45)U/mg·prot]和COPD组[(245±52)、(188±36)U/mg·prot]中-588CCγGCS活性显著高于CT/TT(P<0.01)。结论GCLM-588C/T、-23G/T位点多态性与血浆γGCS活性及COPD易感性相关。

β萘黄酮对大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因表达的影响

目的通过了解外界刺激因子β萘黄酮（β-NF）对大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位（GCLC）基因转录的影响，研究大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ—GCS）基因转录的调节机制。方法利用大鼠GCLC基因调控序列驱动的GCLC—PGL3-enhancer—Luciferase报道载体（GCLC—Luc）转染大鼠支气管上皮细胞（RTE）和肝癌细胞（H4ⅡE），分DMSO空白对照组和不同浓度的各刺激因子组，比较各组荧光素酶值的差异以筛选影响GCLC基因转录调控的刺激因子，并比较筛选到的刺激因子β—NF对GCLC—Luc在RTE和H4ⅡE细胞内表达影响的异同。2种转染后的细胞均分为β—NF实验组（10μmol／L）和DMSO空白对照组，以荧光定量PCR检测各组的细胞内源性γ—GCS转录水平变化。分别将构建的r系列缺失报道载体、GCLC—Luc和激活蛋白1（AP-1）、NF—κB定点突变报道载体转染2种细胞，分β-NF实验组（10μmol／L）与DMSO空白对照组，比较各组荧光素酶值的变化，分析B—NF作用的调节位点和转录调控作用相关元件。结果1、10、100μmol／L的β—NF均强烈抑制RTE中GCLC基因表达，荧光素酶值显著低于DMSO空白对照组（161354-1456、27524-218、15794-294比259714-1662，均P〈0．01）。在H4ⅡE中，1、10、100μmol／L的B—NF则促进其表达，荧光素酶值显著高于DMSO空白对照组（5686±441、13601±746、13978±164比3645±367，均P〈0．01）。荧光定量PCR显示10μmol／L的β-NF作用下，RTE内源性γ—GCS的mRNA表达水平是DMSO空白对照组的0．73倍，在H4ⅡE细胞中则是1．98倍。GCLC—Luc、r系列缺失报道载体转染2种细胞后，RTE中各载体β—NF实验组荧光素酶值均低于DMSO空白对照组（P〈0．01），而H4ⅡE中则高于DMSO空白对照组（P〈0．05）。β-NF作用的调节位点定位于转录起始位点上游-390～＋2bp范嗣内。用针对该区域的AP-1、NF-κB定点突变报道载体转染细胞后，转染GCLC—Lue载体的B—NF实验组RTE荧光素酶值较DMSO空白对照组下降（91．50±0．32）％，与之相比，转染AP-1、NF-κB定点突变报道载体的细胞下降幅度并没有减少（P〉0．05）。在H4ⅡE，β—NF作用下转染GCLC—Lue载体的细胞荧光素酶值上升幅度则高于转染AP-1定点突变报道载体的细胞[（3．81±0．19）倍比（2．08±0．19）倍，P〈0．05]，而与转染NF—κB定点突变报道载体的细胞荧光素酶值上升幅度[（4．41±1．01）倍]相比差异无统计学意义（P〉0．05）。结论在大鼠RTE和H4ⅡE，β—NF影响GCLC基因的表达具有细胞特异性。在大鼠H4ⅡE，β—NF通过激活抗氧化应答元件（ARE）类似的AP-1调控GCLC基因表达。

锌指Krüppel样转录因子2对慢性阻塞性肺疾病支气管上皮细胞中γ谷氨酰半胱氨酸合成酶的作用

目的探讨锌指Krüppel样转录因子2（KLF2）对慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）支气管上皮细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）的调控作用。方法（1）临床试验：收集湖南省肿瘤医院胸外科2008年12月—2009年12月肺癌伴或不伴慢阻肺肺叶切除患者临床肺组织标本，分为慢阻肺组和对照组，应用原位杂交及免疫组化检测两组患者肺组织中KLF2、γ-GCS mRNA及蛋白的表达情况；并对KLF2 mRNA及蛋白与γ-GCS mRNA及蛋白，KLF2及γ-GCS蛋白与吸烟指数、第1秒用力呼气容积（FEV1）占预计值百分比（FEV1 %）、FEV1与用力肺活量（FVC）的比值（FEV1 /FVC）进行相关分析。（2）动物实验：提取大鼠原代支气管上皮细胞，加入10%烟草烟雾提取物（TSE）培养6 h后，用酶联免疫吸附（ELISA）法检测细胞谷胱甘肽（GSH）含量；将KLF2的特异性抑制剂用脂质体转染至细胞中抑制KLF2蛋白表达；再分为KB组（不予任何处理的空白对照组）、KB＋TSE组（加入TSE处理）、NC组（转染miRNA的对照组）、NC＋TSE组（miRNA转染和TSE处理）、92a组（转染KLF2抑制剂）、92a＋TSE组（KLF2抑制剂转染和TSE处理），用逆转录-PCR、Western印迹法观察各组细胞中KLF2、γ-GCS的mRNA及蛋白质表达变化。结果（1）临床试验：慢阻肺组肺组织中KLF2mRNA、蛋白和γ-GCS mRNA、蛋白呈强阳性表达，均显著高于对照组（0.32±0.04比0.19±0.03、0.35±0.05比0.22±0.03和0.28±0.03比0.16±0.03、0.31±0.05比0.21±0.03，均P〈0.01），且两者表达部位一致；KLF2蛋白与γ-GCS mRNA及蛋白表达均呈正相关（r＝0.705、0.722，均P〈0.01），KLF2及γ-GCS蛋白与吸烟指数、FEV1 %、FEV1/FVC均呈正相关（r＝0.552、0.728、0.670及r＝0.631、0.727、0.657，均P〈0.01）。（2）动物实验：大鼠支气管上皮细胞中GSH含量KB＋TSE组显著高于KB组[（28.05±2.04）比（7.27±0.33） nmol/mg，P〈0.01]; KLF2 mRNA、蛋白和γ-GCS mRNA、蛋白表达KB＋TSE组（1.715±0.026、1.842±0.028和2.117±0.067、1.879±0.065）均显著高于KB组（1.130±0.017、1.177±0.033和1.378±0.053、1.177±0.042）, 92a组（0.472±0.028、0.634±0.025和0.582±0.025、0.554±0.021）均显著低于KB组、NC组（1.047±0.056、1.092±0.045和1.303±0.037、1.252±0.037），92a＋TSE组（0.262±0.017、0.288±0.017和0.337±0.022、0.321±0.022）均显著低于KB＋TSE组、92a组、NC＋TSE组（1.576±0.036、1.646±0.066和1.948±0.093、1.843±0.078）（均P〈0.05）。结论KLF2通过调控慢阻肺支气管上皮细胞中γ-GCS的表达而发挥抗氧化作用。

红霉素对4-羟基壬烯醛引起的支气管上皮细胞白细胞介素-8和谷氨酰半胱氨酸合成酶变化的影响

目的探讨红霉素对4-羟基壬烯醛（4-HNE）引起的支气管上皮细胞（16-HBE细胞）前炎因子白细胞介素-8（IL-8）和谷氨酰半胱氨酸合成酶（1-GCS）升高的影响。方法将16-HBE细胞分为4-HNE组（10μmol／L）和健康对照组，每组样本量为4个培养皿，4-HNE刺激细胞0．5,2、4、8及12h后，检测磷酸化c—Jun氨基末端激酶（JNK）、p38丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）、细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）-1及转录激活蛋白-1（AP-1）活性的变化，观察细胞外信号调节激酶活化激酶-1（MEK-1）抑制剂PD98059对4-HNE引起的AP-1结合活性的影响；观察两组IL-8、γ-GCS和IL-8 mRNA、γ-GCS mRNA表达水平的变化；观察PD98059和红霉素对4-HNE引起的IL-8、1-GCS和1-GCS mRNA表达及红霉素对4-HNE引起的AP-1结合活性的影响。结果（1）4-HNE组在0．5,2、4、8及12h各时间段ERK-1分别为110．4±1．6、106．1±2．1、104．4±3．4、96．3±9．6和86．3±2．9，对照组分别为114．6±2．4、110．2±2．0、112．8±2．4、113．1±2．0和115．4±3．8，两组比较差异有统计学意义（均P〈0．05）；4-HNE组各时间段AP-1结合活性表达分别为90．6±2．0、85．7±2．2、78．2±2．6、70．6±1．8和64．9±4．8，对照组分别为98．6±2．1、98．7±3．4、100．1±3．8、101．3±4．2和97．4±3．6，两组比较差异有统计学意义（均P〈0．05）；PD98059可降低4-HNE引起的AP-1结合活性。（2）4-HNE组IL-8水平在2、4、8及12h分别为（87±4）、（98±4）、（102±6）及（117±6）μg/L，对照组分别为（64±4）、（65±6）、（65±5）及（64±7）μg／L，两组比较差异有统计学意义（均P〈0．05）；4-HNE组γ—GCS水平在4、8及12h分别为5．43±0．23、5．41±0．27及5．54±0．53，对照组分别为4．78±0．26、4．03±0．34及3．22±0．31，两组比较差异有统计学意义（均P〈0．05）。4-HNE组比对照组IL-8 mRNA及γ-GCSmRNA表达水平高。（3）PD98059和红霉素可降低4-HNE引起的IL-8和AP-1结合活性，增加4-HNE引起的γ-GCS表达。结论4-HNE可通过ERK．1途径增强AP-1转录活性，促进支气管上皮细胞IL-8表达；红霉素通过抑制AP-1活性，减少4-HNE引起的支气管上皮细胞IL-8的合成。红霉素及PD98059可上调4-HNE对γ-GCS的合成作用，阻断AP-1途径并不能减少支气管上皮细胞γ-GCS的合成。

苯并芘对γ谷氨酰半胱氨酸合成酶调控作用的初步研究

目的分析苯并芘(B(a)P)对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚单位(GCLC)基因的调控作用。方法用超级凝胶滞留实验(Supershift)确认苯并芘(B(a)P)刺激能诱导芳香烃受体核转位因子(ARNT)或其复合物与大鼠GCLC上游调控序列中的E-box元件结合。在不同浓度苯并芘刺激下,在体外通过萤火虫荧光素酶报道系统比较大鼠GCLC5′端全长调控序列及缺失E-box位点的5′端全长调控序列的功能变化,初步确定苯并芘的调控作用。结果B(a)P刺激能够使ARNT或复合物结合E-box元件。用不同浓度的B(a)P于不同的时间点检测,CCL-149细胞荧光素酶活性改变不大(P>0·05)。结论B(a)P刺激能使ARNT与γ-GCS基因上的E-box结合,但这种结合似乎对γ-GCS基因上游调控序列基因的功能影响不大。

蓝莓对四氯化碳所致急性肝损伤大鼠肝组织GCLC mRNA及蛋白表达的影响

目的探讨蓝莓对四氯化碳(CCl4)所致急性肝损伤大鼠肝组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚基(GCLC)mRNA及蛋白表达的影响。方法将50只雄性Wistar大鼠分为5组,即空白组、模型组、蓝莓汁低剂量预防组(蓝低组,10.0g/kg)、蓝莓汁高剂量预防组(蓝高组,20.0g/kg)、联苯双酯预防组(联苯双酯组,0.15g/kg),每组10只,连续灌胃7d,1次/天,其后用CCl4复制大鼠急性肝损伤模型。光镜下观察大鼠肝脏病理学变化,全自动生化分析仪测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性,酶联免疫吸附法检测肝匀浆中丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)活力及含量,分别采用反转录PCR(RT-PCR)、免疫组织化学法、Western blot检测大鼠肝组织中GCLC mRNA及蛋白表达。结果蓝低组、蓝高组和联苯双酯组大鼠肝细胞变性及坏死程度显著轻于模型组(P<0.05),血清ALT、AST及肝匀浆MDA均显著低于模型组(P<0.01),而肝匀浆CAT、SOD、GSH均显著高于模型组(P<0.01),肝组织GCLC mRNA及蛋白表达均显著高于模型组(P<0.01)。3组相比,蓝高组与联苯双酯组效果相似,略优于蓝低组。结论蓝莓对CCl4诱导的大鼠急性肝损伤有一定预防作用,可能与上调大鼠肝脏GCLC表达,减轻氧化应激性肝损伤有关。

阻断肾素血管紧张素系统对长期高脂喂养胰岛素抵抗大鼠胰岛UCP2和GCLC表达的影响

目的:观察长期高脂喂养的胰岛素抵抗大鼠胰岛氧化应激机制以及阻断肾素血管紧张素系统(RAS)对其的影响,探讨RAS与氧化应激、糖代谢之间的关系。方法:雄性Wistar大鼠分为正常饲养组(NC组)、高脂饲养组(HF组)、高脂+培哚普利组(FP组)、高脂+替米沙坦组(FM组),后2组大鼠喂养16周后分别以培哚普利2mg·kg-1.d-1(FP组,n=15)和替米沙坦10mg·kg-1.d-1(FM组,n=15)干预,8周后行正常血糖高胰岛素钳夹试验评估外周胰岛素抵抗程度,行静脉葡萄糖耐量试验检测胰岛β细胞功能,以RT-PCR检测γ谷氨酰半胱氨酸连接酶的催化亚基(GCLC)的表达,以免疫组化法检测胰岛局部线粒体解偶联蛋白2(UCP2)水平,以比色法测定胰腺组织丙二醛(MDA)的含量。结果:与正常饲养组相比,高脂饲养组的葡萄糖输注率(GIR)降低了31.8%,胰岛GCLC表达降低了31.5%,局部UCP2相对浓度增加了17.0%,胰腺MDA含量增加了0.46倍(均P<0.01),0-10min胰岛素曲线下面积(AUC10-10)为(271.8±33.8)vs(282.7±29.8)mIU.L-1.min-1,糖刺激后早期胰岛素分泌降低,但无显著差异;培哚普利或替米沙坦干预后,GIR分别增加了27.8%和30.8%,胰岛GCLC表达分别增加了26.6%和26.6%,局部UCP2相对浓度分别下降了13.0%和15.6%,胰腺MDA含量分别下降了18%和20%(均P<0.01),FP、FM组之间无显著差异。结论:阻断RAS可以改善高脂喂养大鼠的胰岛素抵抗和胰岛β细胞分泌功能,其机制可能为通过下调胰岛局部UCP2和上调GCLC的表达,减轻氧化应激损伤,从而保护胰岛β细胞功能。

白藜芦醇对D-半乳糖致衰老小鼠GCL和GSH含量的影响

目的观察白藜芦醇对D-半乳糖致衰老小鼠脑、心脏和肝脏等不同组织器官中谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)和谷胱甘肽(GSH)含量的影响,探讨白藜芦醇的抗衰老作用。方法将60只小鼠随机分成正常对照组、衰老模型组、白藜芦醇治疗组。衰老模型组和白藜芦醇治疗组小鼠每日皮下注射D-半乳糖(150mg/kg),同时白藜芦醇治疗组每日给予白藜芦醇(20mg/kg)灌胃治疗,42d后处死小鼠,取肝脏、脑和心脏等不同组织测定GCL和GSH含量。结果与正常对照组比较,衰老模型组、白藜芦醇治疗组小鼠肝脏、脑和心脏等不同组织GCL和GSH含量均显著降低(P <0.01),与衰老模型组比较,白藜芦醇治疗组小鼠肝脏、脑和心脏等不同组织GCL和GSH含量均显著增高(P <0.01)。结论白藜芦醇具有抗氧化及延缓小鼠衰老作用。

谷胱甘肽在肿瘤中的研究进展

谷胱甘肽((γ-L-glutamyl-L-cysteinylglycine,glutathiose,GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸缩合而成的含有γ-酰胺键和巯基的三肽,其体内存在形式有两种,分别为氧化型(GSSG)和还原型(GSH),在生理条件下主要以还原型谷胱甘肽GSH为主,GSH几乎存在于身体的每一个细胞。现就谷胱甘肽在肿瘤中的研究进展作一综述。

噻唑烷酸对肝组织GSH含量的影响及其作用机制的研究

建立丁胱亚磺酰亚胺(L-Buthionine Sulfoximine,BSO)排空小鼠肝组织谷胱甘肽(Glutathione,GSH)模型,研究噻唑烷酸(N-acetyl-glucosamine-thiazolidine-4(R)-carboxylic acid,GlcNAcCys)提高肝组织GSH含量,保护肝脏免受外源性毒物、药物损伤的可能机制。正常对照组小鼠腹腔注射生理盐水,BSO组及GlcNAcCys不同剂量组小鼠注射BSO(6mmol/kg体质量,i.p.)。2 h后,正常对照组和BSO组注射生理盐水,GlcNAcCys低、中、高剂量组分别注射不同剂量的GlcNAcCys(200、4009、00 mg/kg体质量)。6 h后,用Ellman’s法测定肝匀浆总巯基(Total Sulfhydryl,T-SH)含量;荧光分光光度法测定GSH含量;用试剂盒检测肝匀浆中谷胱甘肽还原酶(Glutathione Reductase,GR)和谷胱甘肽-S转移酶(Glutathione S-transferase,GST)活性;RT-PCR法检测谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(Glutamyl-L-cysteine Ligase,GCL)基因表达。GlcNAcCys能够提高肝匀浆中T-SH和GSH含量,增强抗氧化酶GR、GST活性,RT-PCR结果显示,GlcNAcCys能够诱导GCL mRNA的表达。GlcNAcCys能够提高肝组织T-SH、GSH的含量,增强GST、GR酶活力,增强肝脏的解毒功能,保护肝脏免受毒性中间代谢物的损伤。GlcNAcCys提高肝组织T-SH、GSH含量的机制与其诱导GCLmRNA的表达有关。

转录因子DEC1和DEC2通过Ebox元件下调大鼠Gclc基因的表达

为研究Ebox元件在谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate-cysteine ligase catalyticsubunit,GCLC)基因表达中的地位,构建含Gclc上游5.9 kb调控序列,及突变Ebox(-3 853～-3 848)的萤火虫荧光素酶报道载体.转染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(L2),比较野生与突变报道载体的转录活性.共转染野生型载体与转录因子分化型胚胎软骨发育基因1/2(differentiated embryochondrocyte expressed gene1/2,DEC1/2)真核表达载体,检测DEC1/2对Gclc转录活性的影响;电泳迁移率(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)和超级迁移率实验(supershift assay)检测Ebox元件是否与DEC1/2特异结合.蛋白免疫印迹技术检测Dec1/2过表达对Gclc表达的影响.结果显示,载体构建符合预期;突变Ebox元件可显著上调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);共转染DEC1/2表达载体显著下调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);EMSA证实Ebox元件(-3 853～-3 848)与核蛋白结合,且特异性强;超级迁移率显示,结合的核蛋白有转录因子DEC1、DEC2;Western印迹结果显示,DEC1/2的表达明显下调Gclc的内源性表达.结果提示,转录因子DEC1与DEC2具有Gclc表达抑制活性,可能与Ebox(-3 853～-3 848)有关.

外周T细胞淋巴瘤组织中GCLC和GCLM的表达及其临床意义

目的:探讨外周T细胞淋巴瘤(PTCL)组织中谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM)的表达及其临床意义。方法:采用免疫组织化学法检测40例PTCL患者组织标本及20例淋巴结反应性增生组织中GCLC和GCLM的表达情况,分析其表达与PTCL患者临床病理特征的关系。结果:GCLC在PTCL组织中的阳性表达率为32.5%(13/40),在淋巴结反应性增生组织中未见明显表达,差异显著(P<0.05)。PTCL组织中GCLM的阳性表达率为35.0%(14/40),高于淋巴结反应性增生组织的10.0%,差异显著(P<0.05)。GCLC和GCLM的表达与PTCL患者的Ann-Arbor临床分期、B症状、国际预后指数(IPI)密切相关(P<0.05),但与患者的年龄、性别、乳酸脱氢酶(LDH)水平、骨髓侵犯均无关(P>0.05),且分期越晚(Ⅲ+Ⅳ期)、IPI(3~5分)越高者,GCLC和GCLM的阳性表达率越高。Spearman等级相关分析显示,PTCL组织中GCLC蛋白与GCLM蛋白的表达呈正相关。结论:GCLC和GCLM在PTCL组织中高表达,可能参与肿瘤的发生和发展,有望为PTCL的病因学研究及治疗提供理论依据。

GCLC基因上游AHR/ARNT元件负性调控GCLC基因在大鼠支气管上皮细胞的表达

研究谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因上游调控序列中2个AHR/ARNT元件的功能,从而了解γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因转录调节特征.分别构建缺失2个位点AHR/ARNT元件的GCLC基因上游近端序列的萤光素酶报道基因载体以及含有2个AHR/ARNT元件核心序列的萤光素酶报道基因载体.转染大鼠支气管上皮细胞(RTE),比较检测野生与缺失报道载体的基因转录调控效率;利用电泳迁移率变动实验(EMSA)和超级迁移率变动实验检测AHR/ARNT元件与AHR以及ARNT因子的特异性结合;通过转染AHR因子真核表达质粒进一步确定AHR/ARNT元件与AHR结合在GCLC基因表达中的最终作用.结果显示,相比其野生序列,缺失AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)和双缺失AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085,-215^-210)的GCLC上游调控序列报道载体在RTE显著提高萤光素酶表达(均P<0.05),而缺失AHR/ARNT元件(-215^-210)则未见显著影响(P>0.05);独立AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)具有转录促进作用(P<0.05)而独立AHR/ARNT元件(-215^-210)无明显影响(P>0.05).转染CMV2-AHR能够抑制野生型和缺失型报道载体的萤光素酶表达(P<0.05).EMSA证实GCLC基因上游调控区域的2个AHR/ARNT元件均有核蛋白结合,并且超级迁移率变动实验显示结合的蛋白主要含有转录因子AHR以及ARNT.因此,2个AHR/ARNT元件均可以与异源二聚体AHR/ARNT结合,AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)是GCLC基因中重要的抑制元件.

高氧暴露对早产鼠肺组织HO-1和GCLC表达的影响

目的 探讨高浓度氧暴露对新生早产大鼠肺组织中血红素加氧酶-1(HO-1)和谷氨酰-L-半胱氨酸连接酶催化亚单位(GCLC)动态表达的影响。方法 受孕21d大鼠行剖宫产取出早产鼠80只,喂养1d后随机分为空气组和高氧组。空气组早产鼠放置在室内常压空气中饲养,高氧组早产鼠放置在同一室内常压氧箱中(氧浓度85%~95%)饲养,分别于第1、4、7、10、14天,每组取8只大鼠,采集两组早产鼠肺组织标本。采用苏木精-伊红染色法检测两组早产鼠不同时间点肺组织结构的病理变化;采用Westernblot技术和RTqPCR检测两组早产鼠不同时间点肺组织HO-1和GCLC蛋白及mRNA的表达变化。结果 与空气组相比,高氧组早产鼠体重下降显著(P<0.05)。与空气组相比,高氧组早产鼠肺组织病理切片显示肺组织结构紊乱、肺泡间隔增宽、肺泡数目减少和肺泡简单化。高氧组早产鼠肺组织中HO-1mRNA相对表达量在第7天时低于空气组,在第10、14天时高于空气组(P<0.05)。高氧组早产鼠肺组织中GCLCmRNA表达量在第1、4、7天时低于空气组,在第10天时高于空气组(P<0.05)。与空气组比较,高氧组早产鼠肺组织中HO-1蛋白表达水平在各时间点均升高;除第1天外,GCLC蛋白表达水平在其他各时间点均升高(P<0.05)。结论 高氧暴露导致早产鼠生长发育迟缓、肺发育阻滞。早产鼠肺组织HO-1和GCLC蛋白及mRNA的表达变化可能与高氧暴露导致早产鼠肺损伤发病过程相关。