谷氨酰胺∶6-磷酸果糖酰基转移酶抑制剂细胞筛选模型的建立

目的 建立己糖胺途径的关键酶谷氨酰胺∶6 磷酸果糖酰基转移酶(glutamine∶fructose 6 phosphateamidotransferase,GFAT)抑制剂的细胞筛选模型。方法 用改进的GDH法测定GFAT的活性。以速效胰岛素依赖的葡萄糖摄取观察细胞对胰岛素的反应性;用长效胰岛素诱导HIRc细胞,形成己糖胺途径过度活跃和胰岛素抵抗的细胞模型,并应用该细胞模型和GDH法筛选GFAT抑制剂。结果 用25nmol·L-1长效胰岛素刺激HIRc细胞36h,可明显激活己糖胺途径,使GFAT活性上升47%;同时产生胰岛素抵抗,使速效胰岛素依赖的葡萄糖摄取能力降低21%。Azaserine可明显抑制该模型中GFAT的活性。结论 长效胰岛素既可过度激活HIRc细胞己糖胺途径,又可使其产生胰岛素抵抗。该模型可用于筛选GFAT抑制剂。

利用柞蚕核型多角体病毒表达系统表达谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶

谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶(glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase,GFAT)是己糖胺生物合成途径(HBP)中的限速酶,与蛋白质糖基化修饰密切相关。本研究克隆的柞蚕GFAT基因(ApGFAT)CDS由2 022个碱基构成,编码674个氨基酸。将该基因连接到柞蚕杆状病毒转移载体pApM748BE后与ApNPV-Δph/egfp+共转染Tn-High Five细胞获得重组病毒。将重组病毒注射到柞蚕蛹体内,收集发病蛹血淋巴,用镍离子螯合柱纯化得到纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测表明,ApGFAT蛋白在柞蚕蛹体内得到成功表达,酶活力为0.978μmol/(min·mg)。

人谷氨酰胺:6-磷酸果糖酰胺转移酶的体外表达、纯化及活性检测

目的:制备重组谷氨酰胺∶6-磷酸果糖酰胺转移酶(GFAT),检测其活性。方法:利用RT-PCR扩增人肝脏cDNA中GFAT1基因全长片段,克隆到表达载体pET32b中;在大肠杆菌Origami(DE3)中诱导表达,用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组GFAT1;用体外酶学的方法检测GFAT的活性。结果:构建了pET32b-GFAT1质粒,经诱导表达及纯化,得到具有一定生物活性的GFAT。结论:利用原核表达系统可得到具有良好生物学活性的重组人GFAT1。

松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶基因克隆与表达

谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶(glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase,GFAT)是己糖胺通路(HBP)的限速酶,参与几丁质的合成和蛋白质的糖基化。本研究利用RACE克隆了松墨天牛GFAT基因(Ma GFAT),Gen Bank登录号为KT362367,其长度为2624 bp,开放阅读框为2061 bp,编码686个氨基酸。序列对比分析显示Ma GFAT与赤拟谷盗相似性最高,为88%,在系统发育树上位于同一分支。采用RT-q PCR方法检测Ma GFAT在松墨天牛不同组织及不同发育时期的表达情况,结果表明:Ma GFAT在各虫态中,成虫中的表达量最高;在成虫部位中,翅的表达量最高;在幼虫各组织中,体壁的表达量最高。本文为研究GFAT结构与功能的关糸奠定基础,为阐明GFAT在松墨天牛几丁质合成中的作用提供参考。

蛋白酪氨酸磷酸酶1B的过度表达抑制GFAT的活性

为探讨蛋白酪氨酸磷酸酶 1B(PTP1B)在细胞中的过度表达对氨基己糖途径之关键酶谷氨酰胺 :6 磷酸果糖酰基转移酶 (GFAT)的作用及其可能的作用机制。通过观察PTP1B在细胞内的过度表达对GFAT的活性及其终产物二磷酸尿嘧啶N 乙酰葡萄糖胺生成的影响及PTP抑制剂正钒酸盐的对抗作用 ,并测定对细胞内GFATmRNA水平和PTP1B对GFAT的直接作用等 ,发现PTP1B在L6、HepG2、3T3 L1和HIRc等细胞中的过度表达可明显抑制GFAT的活性 。

基于果糖1,6-二磷酸酯酶结构设计的药物研究进展

目的果糖1,6-二磷酸酯酶是内源性葡萄糖产生过程中的限速酶,该酶在胰岛素缺乏和胰岛素抵抗的动物模型中体现出控制血糖的重要性,近年来基于果糖1,6-二磷酸酯酶的结构设计出了许多小分子抑制剂,笔者对该领域的研究进展和趋势进行归纳和总结,为开展相关研究提供借鉴。方法通过检索和归纳文献,总结基于酶结构药物设计的思路并综述其抑制剂的设计合成进展。结果报道的小分子抑制剂有望成为2型糖尿病的有效治疗药物,相关研究方法科学、高效。结论基于酶结构的药物设计可以提高药物发现的效率,应用前景广阔。

胰腺癌组织中METTL14和GFPT1的水平表达与临床预后价值研究

目的研究胰腺癌组织中甲基转移酶14(methyltransferase 14,METTL14)及谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶1(glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 1,GFPT1)的表达及其临床意义。方法选取2017年4月~2019年4月上海交通大学附属第六人民医院诊治的86例胰腺癌患者为研究对象。利用实时定量PCR检测癌和癌旁组织中METTL14和GFPT1 mRNA水平表达。利用免疫组织化学检测癌和癌旁组织中METTL14和GFPT1蛋白表达。相关性分析采用Pearson相关分析及Spearman秩相关分析。比较不同胰腺癌患者METTL14和GFPT1蛋白表达与临床病理参数的关系。Kaplan-Meier生存分析胰腺癌组织中METTL14和GFPT1蛋白表达与患者生存预后的关系。单因素及多因素COX模型评价影响胰腺癌预后的因素。结果胰腺癌组织中METTL14 mRNA(5.442±0.437),GFPT1 mRNA(6.521±0.516)表达高于癌旁组织(0.992±0.203,0.895±0.212),差异具有统计学意义(t=85.644,93.525,均P<0.05)。胰腺癌组织中METTL14(73.26%),GFPT1(69.77%)蛋白表达阳性率高于癌旁组织(8.14%,9.30%),差异具有统计学意义(χ^(2)=75.545,65.765,均P<0.05)。胰腺癌组织中METTL14 mRNA与GFPT1 mRNA的表达呈明显正相关性(r=0.569,P<0.05);METTL14蛋白与GFPT1蛋白表达呈明显正相关性(r=0.664,P<0.05)。低分化程度(92.31%,88.46%)、AJCC分期Ⅱ~Ⅲ期(89.13%,86.96%)及有淋巴结转移(95.12%,92.68%)胰腺癌组织中METTL14,GFPT1蛋白表达阳性率分别高于高中分化程度(65.00%,61.67%)、AJCC分期Ⅰ期(55.00%,50.00%)及无淋巴结转移(53.33%,48.89%),差异具有统计学意义(χ^(2)=6.174~19.507,均P<0.05)。METTL14阳性表达组和GFPT1阳性表达组患者三年累积生存率分别低于METTL14阴性表达组,GFPT1阴性表达组(χ^(2)=15.232,18.054,均P<0.05)。肿瘤AJCC分期Ⅱ~Ⅲ期(OR=2.552,95%CI=1.420~4.455)、伴淋巴结转移(OR=1.754,95%CI=1.125~2.534)、METTL14阳性(OR=2.797,95%CI=1.233~5.876)、GFPT1阳性(OR=1.635,95%CI=1.030~2.506)是影响胰腺癌预后的独立危险因素。结论胰腺癌组织中METTL14,GFPT1表达升高,两者与肿瘤AJCC分期、肿瘤分化程度和淋巴结转移有关,可用于评价胰腺癌患者生存预后。

胰岛素抵抗及高血糖对GFAT活性的影响

分别观察了胰岛素抵抗和高血糖水平对己糖胺途径限速酶GFAT活性的影响.在alloxan高血糖小鼠模型中,与正常对照组比较,血清果糖胺水平升高了15.9%,肾组织GFAT活性升高了32.8%;经胰岛素治疗后,血清果糖胺水平降低了9.7%,其肾组织GFAT活性也降低了l9.4%.在高糖高脂饲料诱导的胰岛素抵抗的IR小鼠中,与同批正常对照组比较,正糖钳实验中稳态时葡萄糖输注率G IR值降低了69.3%,胰岛素耐量实验中的AUC值升高了38.1%,其肾脏组织GFAT活性也增加了26.6%.在胰岛素诱导的具有胰岛素抵抗的IR-H IR c细胞模型中,与正常H IR c细胞比较,其10、25 nmol/L胰岛素诱导的葡萄糖摄取能力分别降低了25.3%、21.1%,而GFAT活性分别增加了29.7%、46.5%.可见,GFAT活性与一段时间的平均血糖水平和胰岛素抵抗状态密切正相关.