利用柞蚕核型多角体病毒表达系统表达谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶

谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶(glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase,GFAT)是己糖胺生物合成途径(HBP)中的限速酶,与蛋白质糖基化修饰密切相关。本研究克隆的柞蚕GFAT基因(ApGFAT)CDS由2 022个碱基构成,编码674个氨基酸。将该基因连接到柞蚕杆状病毒转移载体pApM748BE后与ApNPV-Δph/egfp+共转染Tn-High Five细胞获得重组病毒。将重组病毒注射到柞蚕蛹体内,收集发病蛹血淋巴,用镍离子螯合柱纯化得到纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测表明,ApGFAT蛋白在柞蚕蛹体内得到成功表达,酶活力为0.978μmol/(min·mg)。

谷氨酰胺∶6-磷酸果糖酰基转移酶抑制剂细胞筛选模型的建立

目的 建立己糖胺途径的关键酶谷氨酰胺∶6 磷酸果糖酰基转移酶(glutamine∶fructose 6 phosphateamidotransferase,GFAT)抑制剂的细胞筛选模型。方法 用改进的GDH法测定GFAT的活性。以速效胰岛素依赖的葡萄糖摄取观察细胞对胰岛素的反应性;用长效胰岛素诱导HIRc细胞,形成己糖胺途径过度活跃和胰岛素抵抗的细胞模型,并应用该细胞模型和GDH法筛选GFAT抑制剂。结果 用25nmol·L-1长效胰岛素刺激HIRc细胞36h,可明显激活己糖胺途径,使GFAT活性上升47%;同时产生胰岛素抵抗,使速效胰岛素依赖的葡萄糖摄取能力降低21%。Azaserine可明显抑制该模型中GFAT的活性。结论 长效胰岛素既可过度激活HIRc细胞己糖胺途径,又可使其产生胰岛素抵抗。该模型可用于筛选GFAT抑制剂。

人谷氨酰胺:6-磷酸果糖酰胺转移酶的体外表达、纯化及活性检测

目的:制备重组谷氨酰胺∶6-磷酸果糖酰胺转移酶(GFAT),检测其活性。方法:利用RT-PCR扩增人肝脏cDNA中GFAT1基因全长片段,克隆到表达载体pET32b中;在大肠杆菌Origami(DE3)中诱导表达,用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组GFAT1;用体外酶学的方法检测GFAT的活性。结果:构建了pET32b-GFAT1质粒,经诱导表达及纯化,得到具有一定生物活性的GFAT。结论:利用原核表达系统可得到具有良好生物学活性的重组人GFAT1。

谷氨酰胺:6-磷酸果糖酰胺基转移酶多克隆抗体的制备及应用

目的:采用原核表达系统表达和纯化重组谷氨酰胺∶6-磷酸果糖酰胺基转移酶(GFAT),制备GFAT多克隆抗体,并用以研究在糖尿病发生发展过程中GFAT的表达情况。方法:通过生物信息学分析其抗原性和属间同源性,选择需要的基因区域;利用RT-PCR扩增小鼠肝脏cDNA中GFAT基因片段,克隆到表达载体pET28b中;在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组GFAT;用纯化的重组GFAT免疫BALB/c小鼠后得到多克隆抗体;用Western印迹检测正常小鼠、高血糖小鼠及胰岛素抵抗小鼠的组织GFAT的表达。结果:Western印迹分析表明,制备的GFAT抗体具有较高的特异性,可特异性识别重组GFAT和正常小鼠肝脏、肾脏、骨骼肌和肺组织的GFAT;与正常小鼠相比,高脂饲料诱导的胰岛素抵抗小鼠肌肉组织的GFAT表达升高约1.8倍,肝脏组织则略有升高;高血糖小鼠肌肉组织和肝脏组织的GFAT表达也略有上升,但无统计学差异。结论:利用原核表达及Ni-NTA纯化系统可制备小鼠GFAT多克隆抗体;正常小鼠骨骼肌GFAT表达较高;肌肉组织的GFAT表达在胰岛素抵抗小鼠显著性升高,而与小鼠血糖水平无明显相关性。

α-硫辛酸对糖尿病小鼠骨骼肌谷氨酰胺6磷酸果糖转氨酶1表达的影响

测定了四氧嘧啶制成的糖尿病小鼠模型骨骼肌的谷氨酰胺-6磷酸果糖转氨酶1(GFAT1)的mRNA表达水平。给予α硫辛酸治疗的糖尿病小鼠,骨骼肌内丙二醛水平低于不予治疗的糖尿病小鼠,而骨骼肌内GFAT-1的mRNA表达水平也低于不治疗组。

松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶基因克隆与表达

谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶(glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase,GFAT)是己糖胺通路(HBP)的限速酶,参与几丁质的合成和蛋白质的糖基化。本研究利用RACE克隆了松墨天牛GFAT基因(Ma GFAT),Gen Bank登录号为KT362367,其长度为2624 bp,开放阅读框为2061 bp,编码686个氨基酸。序列对比分析显示Ma GFAT与赤拟谷盗相似性最高,为88%,在系统发育树上位于同一分支。采用RT-q PCR方法检测Ma GFAT在松墨天牛不同组织及不同发育时期的表达情况,结果表明:Ma GFAT在各虫态中,成虫中的表达量最高;在成虫部位中,翅的表达量最高;在幼虫各组织中,体壁的表达量最高。本文为研究GFAT结构与功能的关糸奠定基础,为阐明GFAT在松墨天牛几丁质合成中的作用提供参考。

兔抗人谷氨酰胺果糖6磷酸氨基转移酶1(GFPT1)多克隆抗体的制备及应用

目的 制备特异性识别人谷氨酰胺果糖6磷酸氨基转移酶1(GFPT1)的兔多克隆抗体。方法 通过比对GFPT1及其高度同源的同工酶GFPT2的蛋白质序列,针对GFPT1的特异性序列设计并合成2个多肽,多肽与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联作为抗原免疫新西兰大白兔,3次加强免疫后得到抗血清,采用ELISA检测抗血清效价。构建GFPT1和GFPT2的大肠杆菌表达载体,诱导表达获得GFPT1和GFPT2重组蛋白,通过Western blot法检测GFPT1和GFPT2重组蛋白以验证抗血清的特异性、免疫荧光细胞化学染色检测786-O细胞GFPT1的表达验证获得的抗血清能否识别内源性表达的GFPT1。结果 获得了特异性识别GFPT1的多克隆抗体,效价高达1∶1 458 000,该抗体可用于Western blot法以及免疫荧光细胞化学染色。结论 成功制备了特异性识别GFPT1的兔多克隆抗体。

谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶1相关性肢带型先天性肌无力综合征二例临床分析

目的 观察2例谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶1（GFPT1）相关性肢带型先天性肌无力综合征患者的临床、电生理及病理改变特点.方法 收集于2014年3月和2014年6月就诊于北京大学第一医院神经内科并诊断为GFPT1相关性肢带型先天性肌无力综合征的2例患者,回顾性分析2例患者的临床资料、实验室、电生理、肌肉病理及基因检查结果,总结本病的临床特点,并随访其治疗效果.结果 例1男性,16岁,活动后易疲劳10年.例2男性,9岁,活动后易疲劳6年.2例患者体检均显示四肢近端肌力Ⅳ级.例1血清肌酸激酶轻度升高（224 IU/L）,例2正常.例1、例2腋神经3 Hz重复神经电刺激复合肌肉动作电位波幅分别递减46.9％、17.5％.2例患者血清乙酰胆碱受体抗体水平均正常,给予溴吡斯的明治疗后症状均得到明显改善.例1骨骼肌内可见肌纤维内大量管聚集,例2Ⅰ型肌纤维病理占优势.2例患者经GFPT1基因检查均存在2个复合杂合突变,例1分.别为p.Y367C和p.G564C,例2分别为p.G26S和p.V291I.结论 GFPT1相关性肢带型先天性肌无力综合征多为儿童期起病,以波动性肌无力、肢带型肌无力为主要表现,低频刺激下波幅递减、肌肉病理出现管聚集可作为诊断线索.胆碱酯酶抑制剂为治疗本病的首选药物.

电针介导AMPK/GFAT-1/VEGF对缺血性脑卒中小鼠脑血流量及运动功能的影响

目的观察电针“百会”“大椎”穴对缺血性脑卒中小鼠脑血流量及运动功能的影响,揭示腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/谷氨酰胺-6-磷酸果糖转氨酶-1(glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase-1,GFAT-1)/血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)分子通路参与电针减轻血管损伤,改善肢体运动功能的作用机制。方法将C57雄性小鼠随机分为假手术组、模型组、电针组,每组6只。采用光栓法制备缺血性脑卒中小鼠模型。采用走格子测试和爬杯实验评估小鼠运动功能;TTC染色和激光散斑血流成像仪评估脑梗死体积与脑血流灌注量变化;Western blot法检测AMPK、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK,p-AMPK)、GFAT-1、VEGF的表达水平。结果与假手术组比较,模型组小鼠运动功能受损(P<0.05),脑梗死体积增加(P<0.05),脑血流灌注量减少(P<0.05),AMPK、p-AMPK、VEGF蛋白表达水平显著降低(P<0.05),GFAT-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,电针组小鼠运动功能显著改善(P<0.05),脑梗死体积显著减小(P<0.05),脑血流灌注量显著增加(P<0.05),AMPK、p-AMPK、VEGF蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),GFAT-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论电针可能通过介导AMPK/GFAT-1/VEGF分子通路,参与改善脑皮质缺血所致脑血管损伤和运动功能障碍。

肝细胞肝癌组织中miR-143-3p、GFPT2表达变化及意义

目的探讨肝细胞肝癌(HCC)组织中微小RNA-143-3p(miR-143-3p)、谷氨酰胺果糖-6-磷酸转氨酶2(GFPT2)的表达变化及临床意义。方法选取HCC患者106例,术中收集其HCC组织与癌旁正常组织(距离肿瘤边缘>5 cm)。用实时荧光定量PCR法检测组织中miR-143-3p、GFPT2 mRNA的表达,Pearson相关法分析HCC组织中miR-143-3p与GFPT2 mRNA表达的相关性,分析HCC组织中miR-143-3p、GFPT2 mRNA表达与患者临床病理特征的关系,Kaplan-Meier法分析miR-143-3p、GFPT2 mRNA表达与患者预后的关系。结果与癌旁正常组织比较,HCC组织中miR-143-3p相对表达量低(P=0.000),GFPT2相对表达量高(P=0.000)。HCC组织中miR-143-3p与GFPT2 mRNA表达呈负相关(r=-0.558,P=0.000)。HCC组织中miR-143-3p、GFPT2 mRNA表达与肿瘤门静脉侵犯、TNM分期有关(P均<0.05)。106例HCC患者随访2~60(32.7±6.5)个月,随访期间死亡65例。以HCC组织中miR-143-3p相对表达量均数0.843为临界值,分为miR-143-3p高表达组51例、miR-143-3p低表达组55例。与miR-143-3p高表达组比较,miR-143-3p低表达组5年总体生存率(OS)低(P=0.012),生存时间短(P=0.000)。以HCC组织中GFPT2 mRNA相对表达量均数1.623为临界值,分为GFPT2高表达组52例、GFPT2低表达组54例。与GFPT2低表达组比较,GFPT2高表达组5年OS低(P=0.000),生存时间短(P=0.000)。结论HCC组织中miR-143-3p低表达,GFPT2高表达;二者均参与HCC的发生发展,并影响患者预后。

蛋白酪氨酸磷酸酶1B的过度表达抑制GFAT的活性

为探讨蛋白酪氨酸磷酸酶 1B(PTP1B)在细胞中的过度表达对氨基己糖途径之关键酶谷氨酰胺 :6 磷酸果糖酰基转移酶 (GFAT)的作用及其可能的作用机制。通过观察PTP1B在细胞内的过度表达对GFAT的活性及其终产物二磷酸尿嘧啶N 乙酰葡萄糖胺生成的影响及PTP抑制剂正钒酸盐的对抗作用 ,并测定对细胞内GFATmRNA水平和PTP1B对GFAT的直接作用等 ,发现PTP1B在L6、HepG2、3T3 L1和HIRc等细胞中的过度表达可明显抑制GFAT的活性 。

人工合成六倍体小麦苗期氮、糖代谢关键酶基因的表达

以人工合成异源六倍体小麦为材料,采用RT-PCR技术,对六倍体小麦多倍化初期氮、糖代谢关键酶基因(GS1、GS2、G6PDH、SPS)的表达情况进行了研究。结果表明,六倍体小麦GS1基因表达水平较其双亲中值(MPV)显著升高,GS2基因表达水平与其亲本基本一致,而G6PDH基因和SPS基因表达水平较其MPV出现了不同程度的降低。

胰腺癌组织中METTL14和GFPT1的水平表达与临床预后价值研究

目的研究胰腺癌组织中甲基转移酶14(methyltransferase 14,METTL14)及谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶1(glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 1,GFPT1)的表达及其临床意义。方法选取2017年4月~2019年4月上海交通大学附属第六人民医院诊治的86例胰腺癌患者为研究对象。利用实时定量PCR检测癌和癌旁组织中METTL14和GFPT1 mRNA水平表达。利用免疫组织化学检测癌和癌旁组织中METTL14和GFPT1蛋白表达。相关性分析采用Pearson相关分析及Spearman秩相关分析。比较不同胰腺癌患者METTL14和GFPT1蛋白表达与临床病理参数的关系。Kaplan-Meier生存分析胰腺癌组织中METTL14和GFPT1蛋白表达与患者生存预后的关系。单因素及多因素COX模型评价影响胰腺癌预后的因素。结果胰腺癌组织中METTL14 mRNA(5.442±0.437),GFPT1 mRNA(6.521±0.516)表达高于癌旁组织(0.992±0.203,0.895±0.212),差异具有统计学意义(t=85.644,93.525,均P<0.05)。胰腺癌组织中METTL14(73.26%),GFPT1(69.77%)蛋白表达阳性率高于癌旁组织(8.14%,9.30%),差异具有统计学意义(χ^(2)=75.545,65.765,均P<0.05)。胰腺癌组织中METTL14 mRNA与GFPT1 mRNA的表达呈明显正相关性(r=0.569,P<0.05);METTL14蛋白与GFPT1蛋白表达呈明显正相关性(r=0.664,P<0.05)。低分化程度(92.31%,88.46%)、AJCC分期Ⅱ~Ⅲ期(89.13%,86.96%)及有淋巴结转移(95.12%,92.68%)胰腺癌组织中METTL14,GFPT1蛋白表达阳性率分别高于高中分化程度(65.00%,61.67%)、AJCC分期Ⅰ期(55.00%,50.00%)及无淋巴结转移(53.33%,48.89%),差异具有统计学意义(χ^(2)=6.174~19.507,均P<0.05)。METTL14阳性表达组和GFPT1阳性表达组患者三年累积生存率分别低于METTL14阴性表达组,GFPT1阴性表达组(χ^(2)=15.232,18.054,均P<0.05)。肿瘤AJCC分期Ⅱ~Ⅲ期(OR=2.552,95%CI=1.420~4.455)、伴淋巴结转移(OR=1.754,95%CI=1.125~2.534)、METTL14阳性(OR=2.797,95%CI=1.233~5.876)、GFPT1阳性(OR=1.635,95%CI=1.030~2.506)是影响胰腺癌预后的独立危险因素。结论胰腺癌组织中METTL14,GFPT1表达升高,两者与肿瘤AJCC分期、肿瘤分化程度和淋巴结转移有关,可用于评价胰腺癌患者生存预后。

低氧对大鼠睾丸部分生化指标影响

目的通过研究低氧对大鼠睾丸中部分生化指标的影响,探讨低氧对精子发生局部环境的影响。方法将成年雄性Wistar大鼠随机分为4组:常氧对照组、低氧5 d组、低氧15 d组和低氧30 d组。低氧各组置低氧舱内模拟5000 m高原减压。采用生化法测定各组大鼠睾丸组织中乳酸脱氢酶同工酶C4与乳酸脱氢酶的比值(LDH-C4/LDH)和γ-谷氨酰胺转移酶(GGT)活性,以及果糖、丙二醛含量。结果低氧30 d组大鼠睾丸组织LDH-C4/LDH显著低于常氧对照组(P<0.05);低氧30 d组GGT活性显著高于常氧对照组(P<0.05)。低氧各组睾丸组织果糖含量与常氧对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。低氧各组大鼠睾丸组织丙二醛含量均显著低于常氧对照组(P<0.05)。结论低氧引起精子发生的环境改变,提示低氧影响精子的发生。

胰岛素抵抗及高血糖对GFAT活性的影响

分别观察了胰岛素抵抗和高血糖水平对己糖胺途径限速酶GFAT活性的影响.在alloxan高血糖小鼠模型中,与正常对照组比较,血清果糖胺水平升高了15.9%,肾组织GFAT活性升高了32.8%;经胰岛素治疗后,血清果糖胺水平降低了9.7%,其肾组织GFAT活性也降低了l9.4%.在高糖高脂饲料诱导的胰岛素抵抗的IR小鼠中,与同批正常对照组比较,正糖钳实验中稳态时葡萄糖输注率G IR值降低了69.3%,胰岛素耐量实验中的AUC值升高了38.1%,其肾脏组织GFAT活性也增加了26.6%.在胰岛素诱导的具有胰岛素抵抗的IR-H IR c细胞模型中,与正常H IR c细胞比较,其10、25 nmol/L胰岛素诱导的葡萄糖摄取能力分别降低了25.3%、21.1%,而GFAT活性分别增加了29.7%、46.5%.可见,GFAT活性与一段时间的平均血糖水平和胰岛素抵抗状态密切正相关.

PFP的研究进展

焦磷酸：果糖－６－磷酸１－磷酸转移酶（ＰＦＰ）可催化果糖－６－磷酸与果糖－１，６－二磷酸间的可逆转变．该酶广泛存在于各种高等植物及一些微生物体内．文章综述了９０年代以来有关ＰＦＰ的一些研究进展．包括：ＰＦＰ的种类与亚基构成、活性中心、底物特异性、酶活性的调节及功能等．

药用植物质量标志物多糖生物合成通路及关键酶研究进展

多糖是众多药用植物中重要的质量标志物,在免疫调节、抗肿瘤等方面具有显著的药理作用。多糖是一类结构复杂、种类繁多、组合多样的生物大分子,其生物合成通路主要包括蔗糖转化、尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate,UDP)-葡萄糖至其他NDP单糖的转化、多糖聚合3个部分。在这一合成过程中涉及的关键酶主要包括蔗糖合成酶(sucrose synthase,SUS)、果糖-6磷酸酯在蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,SPS)、蔗糖由转化酶(invertase,INV)、己糖激酶(hexokinase,HK)、果糖激酶(fructokinase,FRK)、UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH)、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)、UDP-鼠李糖合成酶(UDP-rhamnose synthase,RHM)、磷酸甘露糖突变酶(phosphomannose isomerase,PMM)、GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GMPP)、糖基转移酶(glycosyl transferases,GTs)等。选取以多糖为主要质量标志物的药用植物为探讨对象,对其多糖生物合成通路、关键酶作用机制及单糖组成进行归纳分析,并对研究中存在的问题和可能的解决思路进行了梳理和展望。对明确药用植物质量标志物多糖生物合成通路,了解关键酶作用机制具有一定的参考价值。

PPP2R2A在乳腺癌细胞中结合GFPT2并导致其去磷酸化

PPP2R2A是PP2A磷酸酶的调控亚基之一,以往的研究报道显示,PPP2R2A可促进肿瘤细胞生存和生长。本研究通过串联亲和纯化联合HPLC-Chip-ESI/MS/MS筛选PPP2R2A的相互作用蛋白质,分析结果显示,L-谷氨酰胺-D-果糖-6-磷酸转氨酶1(Glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 1,GFPT1)和L-谷氨酰胺-D-果糖-6-磷酸转氨酶2(Glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 2,GFPT2)是PPP2R2A可能的结合蛋白。通过免疫荧光共定位、GST Pull-down和免疫共沉淀等方法,进一步确认了PPP2R2A和GFPT1及GFPT2的相互结合。通过shRNA下调PPP2R2A后,GFPT2的磷酸化水平显著增加,但GFPT1的磷酸化水平改变不明显。GFPT2是O-GlcNAC糖基化修饰通路中的一个限速酶,在乳腺癌细胞MDA-MB-231中下调PPP2R2A后,蛋白质O-GlcNAC糖基化修饰水平增加。这些结果表明,PPP2R2A可直接结合GFPT2,并导致其去磷酸化,进而影响细胞内O-GlcNAC糖基化修饰。

NMNAT2蛋白水平上调对细胞能量代谢影响的研究

目的探讨烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶2(NMNAT2)上调造成神经元损伤的机制。方法HEK293T细胞过表达NMNAT2后,检测细胞糖酵解水平的改变,同时免疫印迹检测糖酵解限速酶和线粒体能量代谢相关蛋白表达水平的变化以及AMPK活性的改变。之后通过立体定位注射技术将腺相关病毒打入小鼠海马CA1区上调NMNAT2。免疫印迹检测在体过表达NMNAT2后上述细胞能量代谢相关蛋白的变化。结果HEK293T细胞过表达NMNAT2后,细胞外液的乳酸含量下降,6-磷酸果糖激酶-1和Sirt3的表达水平降低,AMPK活性增强。在体过表达NMNAT2后,Sirt3的表达水平降低,AMPK活性增强。结论 NMNAT2蛋白水平上调对细胞能量代谢的不利影响可能是造成神经元损伤的机制之一。