采用TG和DSC方法研究糖类对谷氨酰胺转胺酶热稳定性的影响

谷氨酰胺转胺酶(TGase)是一种催化蛋白质分子间产生共价交联的硫醇酶类,但其热稳定性较差。在40～60℃之间,通过添加海藻糖、蔗糖和葡萄糖作为TGase的保护剂,TGase酶活残留率均比对照组升高,其中海藻糖的保护最为显著。采用TG和DSC分析方法,与对照组相比,三种糖中海藻糖提高了TGase的相变温度(Tm),△Tm值为29℃,相变热焓△H上升26.4J/g,失重率降低了2.8%。对应于上述热力学参数,葡萄糖和蔗糖的加入则并未表现与海藻糖相同的趋势。

粘虫谷氨酰胺转胺酶(MsTGase)活力测定条件的正交优化及其在幼虫体内的分布

【目的】本研究旨在优化Grossowicz氧肟酸比色法测定粘虫Mythimna separata谷氨酰胺转胺酶(Ms TGase)活力的组合条件,以Ms TGase酶活力为依据分析其在不同龄期幼虫体内的分布规律。【方法】取4龄粘虫幼虫,通过组织匀浆和沉析纯化制备Ms TGase,采用Grossowicz比色法测定Ms TGase酶活力,并对Grossowicz比色法的多重实验因素进行正交优化,进一步结合差速离心法分析不同龄期幼虫体内和亚细胞组分(细胞核和细胞碎片,线粒体,微粒体以及胞质溶胶)中Ms TGase酶活力。【结果】结果表明,酶浓度、底物浓度、反应体系pH值、反应温度及钙离子浓度等实验因素都对Ms TGase酶活力测定结果产生显著影响,其影响大小顺序为:酶浓度>温度> p H>底物浓度>Ca2+浓度。Ms TGase酶比活力测定的最优化条件:酶浓度20 mg/m L、底物浓度0. 04 mol/L、反应体系pH值6. 5、测定温度37℃,不添加钙离子。在1-5龄幼虫中以4龄幼虫的Ms TGase酶活力最高,其比活力也显著高于其他龄期的,且在1-5龄幼虫胞质溶胶中Ms TGase酶活力分别占各亚细胞组分酶活力总和的39%,25%,48%,60%和61%。【结论】所获得的最优化条件适用于粘虫Ms TGase酶活力测定。Ms TGase在粘虫体内呈显著的龄期表达特征和亚细胞分布规律。

谷氨酰胺转胺酶的分离纯化及酶学性质

茂原链轮丝菌Streptoverticilliummobaraense所产生的谷氨酰胺转胺酶发酵液通过抽滤、超滤、乙醇沉淀、离心和冷冻干燥,制得粗酶粉的酶活约为1033U/g.对粗酶研究发现,该酶的最适反应温度为52℃,最适pH为6.0;粗酶的pH稳定范围在4～8,温度稳定范围在20～40℃,离子强度对该酶的活性稍有影响.粗酶经CM 纤维素层析和SephadexG 75凝胶过滤层析后得到较纯的酶,通过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检验蛋白质纯度,得到较弱的单一区带.其中,CM 纤维素层析的纯化倍数为4.5,收率质量分数约为78.8%;凝胶过滤层析纯化倍数为1.11,收率质量分数为50%;用凝胶过滤法测得谷氨酰胺转胺酶的相对分子质量为40092.

转谷氨酰胺酶交联乳蛋白对新鲜干酪特性的影响

利用转谷氨酰胺酶(TG)交联酪蛋白,研究其对新鲜干酪凝乳的成分和质构特征的影响。结果表明,TG能够加速凝乳发酵过程,提高乳中蛋白质和脂肪的回收率,并显著降低了乳清中的蛋白含量,对凝乳的质构特征也具有明显修饰作用。但与凝乳酶同时作用时,TG酶对凝乳的修饰作用不显著。

产谷氨酰胺转胺酶菌株的筛选及其产酶条件研究

利用设计的低廉简便的凝胶法从土壤中分离得到1株高产谷氨酰胺转胺酶(microbialtransglutami-nase,MTG)的菌株,初步鉴定属于放线菌纲的链霉菌属(Streptomycessp.)。摇瓶发酵试验表明,其最适产酶氮源和碳源分别是蛋白胨和葡萄糖,通过正交试验确定最适产酶培养基为(g/L):葡萄糖20.0,蛋白胨20.0,酵母提取物3.0,MgSO4·7H2O2.0,K2HPO4·3H2O2.0,KH2PO42.0,CaCO35.0。单因素试验确定最佳培养时间和最适pH分别为72h和7.0;在优化条件下,发酵液中MTG酶活达1.04U/mL。

培养基组成对轮枝链霉菌合成谷氨酰胺转胺酶的影响

对产谷氨酰胺转胺酶菌种轮枝链霉菌 (Streptoverticillium )SK 1的摇瓶条件进行了研究 ,结果表明当起始 pH值为 6.5～ 8.0 ,氮源、碳源为蛋白胨与甘油 ,培养时间为 110h时 ,酶活最高可达 1.8μmol/ (min·mL) .

一些蛋白质和多肽对谷氨酰胺转胺酶热稳定性的影响

谷氨酰胺转胺酶(TGase)是一种催化蛋白质分子间产生共价交联的硫醇酶类,但其热稳定性较差,通过35～60℃之间的热处理研究,发现谷朊粉、大豆多肽、乳清蛋白、酪蛋白酸钠、乳清粉和脱脂乳6种蛋白和多肽物质对TGase酶活都表现出保护作用,其中酪蛋白酸钠和乳清蛋白较为显著。采用TG/DSC分析,我们获得了上述六种蛋白物质对TGase的相变温度(Tm),相变热焓(ΔH)和失重率(LW)影响的数据,其中酪蛋白酸钠对TGase的三种热力学参数改变最大,分别为32℃,40.5J/g和-7.0%。加入0.1%～2.0%的上述6种蛋白和多肽物质对TGase的冻干过程也具有保护作用,以0.5%的谷朊粉添加效果较好。

谷氨酰胺转胺酶胶凝肌球蛋白的机理研究

对10%的肌球蛋白体系而言,加入10u/g蛋白质的谷氨胺酰转胺酶获得最大凝胶强度的条件为温度35℃,PH=7.0,反应时间90min。高浓度的肌球蛋白溶液加入0.02%u/mg蛋白质的谷氨酰胺转胺酶,37℃保温60min,形成可倒置的凝胶。扫描电子显微镜(SEM)观察该凝胶,结果表明此凝胶形成了致密的三维网状结构。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-DAGE分析反应产物,发现随着反应时间的延长,单体蛋白的带在减少,相应形成的大分子聚合物的量在增加,这说明谷氨酰胺转胺酶通过催化蛋白质之间的共价交联,从而增强了蛋白质凝胶结构的强度。

谷氨酰胺转胺酶对大豆面包品质及加工特性的影响

研究在含12.5%大豆粉的面粉中添加不同水平的谷氨酰胺转胺酶(TG)(0.25%、0.50%、0.75%和1.00%)对形成面团的粉质特性、拉伸特性、超微结构以及面包烘焙品质的影响。结果表明:混合粉中添加不同水平的TG后与未加TG的混合粉相比,面团的吸水率增加,面团的形成时间和稳定时间增加,面团的弱化度有所下降。添加不同水平的TG后,面团的抗拉伸阻力Rmax增加,延伸性下降。在0.50%～0.75%范围内添加TG可改善富含大豆粉面团的超微结构和面包的烘焙品质。

微生物谷氨酰胺转胺酶高产菌株的诱变选育

以本实验室筛选的Streptomyces sp.WZFF.W-12(谷氨酰胺转胺酶活0.24U/ml)为出发菌株,孢子经预培养处理处于萌发状态后制备成单孢子悬浮液,用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)单独和结合羟胺进行多次复合诱变处理。实验发现,诱变处理后菌落的形态变异等特征与产酶能力呈相关关系,并被用于最初的突变菌落挑选。接着先后采用蛋白质交联凝絮-沉淀性能分析的初筛试验和摇瓶测定酶活的复筛试验分离选育高产酶突变菌株,最后获得一产酶活力达2.18U/ml的高产菌株W-12var HZ3,酶活相对提高了8倍。对该菌株进行分类鉴定方面的理化性能测试和传代实验结果表明,该菌遗传性较为稳定,而且其理化性能与已报道的产酶菌种明显不同。

谷氨酰胺转胺酶的分离纯化及酶学性质的研究

对灰轮丝链轮丝菌ZC60所产生的谷氨酰胺转胺酶采用(NH4)2SO4盐析、透析脱盐、冷冻浓缩和SephadexG-100凝胶过滤层析进行纯化,经SDS-PAGE检测,样品达到电泳级纯。对冷冻浓缩后得到的粗酶的酶学性质进行研究,得到该酶的最适反应温度为50℃,最适pH为7.0;酶的温度稳定范围为0～50℃,pH稳定范围为6.0～7.5;K+、Na+、Ca2+、Ba2+、Mg2+对MTG的活性几乎没有影响,而Pb2+,Cu2+抑制酶活。

微生物谷氨酰胺转胺酶作用机制及检测方法研究进展

微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)在食品、医药、生物技术等领域具有优良的品质及广泛的应用前景。本文简要介绍了MTG的结构、作用机理以及目前国内外检测方法的原理。并对检测方法的适用性、优缺点进行适当评述。随着MTG应用的日益广泛,对其活性的检测要求也在不断地提高。建立其安全、准确、灵敏度高、重现性好的检测体系日益成为研究的热点。

链霉菌生产谷氨酰胺转胺酶的发酵工艺条件研究

以本实验室从土壤分离并经诱变筛选得到的链霉菌 Streptomyes sp.WZFF.W—12.var MN-35为出发菌株, 首先在摇瓶条件下,对微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)发 酵生产过程中的主要培养基组成、培养条件及各种蛋白 酶抑制剂对菌体生长和产酶能力的影响进行了研究。结 果表明,发酵生产MTG的合适碳氮源分别为可溶性淀 粉与葡萄糖和多价胨,其最佳碳氮比(C/N)为5:5,适宜 的接种龄、接种量、初始pH、培养温度、搅拌速度等工艺 条件分别为24h、7％～10％、pH6.5～7.0、30℃和200r/min, MTG酶活最高可达1.63U/mL。当在优化培养基中进一 步加入一种蛋白酶抑制剂后,酶活又提高了19.0％。在这 些最佳工艺条件下采用简易的小型生化反应器培养该链 霉菌株,酶活稳定在2.0U/mL以上。

羊毛的蛋白酶／转谷氨酰胺酶防缩整理工艺研究

转谷氨酰胺酶(TG)作为一种生物催化剂,应用于蛋白酶防缩整理能修复蛋白酶对羊毛的损伤(织物经双氧水和蛋白酶两步处理后,面积毡缩率下降了6%～8%,再经TG酶修复处理,面积毡缩率又可下降1%～2%),提高羊毛强力.研究了蛋白酶结合转谷氨酰胺酶的防缩整理工艺,结果表明:经蛋白酶处理[2%(owf)蛋白酶处理40 min]后的织物,再用32%(owf)的TG酶处理2 h,与单经蛋白酶处理相比,织物强力提高约20%,面积毡缩率进一步下降.用SEM观察纤维的表面形态,并初步分析了TG酶对羊毛的作用机理.

微生物谷氨酰胺转胺酶的研究进展

谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺转胺酶EC2.3.2.13,TG)能催化蛋白质分子内或分子间的酰基转移反应,通过形成交联键改善蛋白质的功能性质。其酶活测定方法采用比色法,荧光法、偶联法、放射标记法目前只用于动物TG酶的活性测定;MTG(微生物谷氨酰胺转胺酶)作为胞外酶,从其发酵液中分离纯化MTG主要是用离子交换、凝胶层析、高效液相色谱、超滤等方法;MTG可用于肉食品、大豆蛋白和小麦制品等的加工。

微生物发酵谷氨酰胺转胺酶的超滤过程研究

将Streptoverticillium mobaraense发酵得到的谷氨酰胺转胺酶粗酶液进行凝胶层析,采用SDS-PAGE电泳得到了谷氨酰胺转胺酶的分子质量在37ku左右,pI值在8.7～9.0。对超滤过程TGase的酶活损失和超滤膜通量综合考虑,确定超滤过程温度控制在8℃左右比较适宜,在此基础上,考察了对膜通量有较大影响的酶液pH值和超滤压力等因素。实验结果表明,将料液pH调节到7.5左右,压力控制在0.20～0.25MPa比较理想。

玉米谷氨酰胺转胺酶基因的克隆及原核表达

从玉米嫩叶中提取总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出玉米谷氨酰胺转胺酶(TGase)全长基因,回收目的片段并测序,该基因编码区全长1605bp,编码535个氨基酸残基,分子量为60.9kD,与GenBank(登录号:AJ421525)上已发表的序列同源性为100%。按正确的阅读框架将玉米TGase基因片段定向克隆到表达载体pET-28a上,将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株,1mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,经凝胶分析软件测得蛋白表达量约占总蛋白的15%,以His-Tag抗体作为一抗,采用Western-blot方法检测目的蛋白,结果证明所表达的特异蛋白是带有His-Tag的重组融合蛋白,利用Ni2+-NTA琼脂糖树脂亲和层析柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定为单一条带,测得纯化后的TGase酶活力达到16U/mg。

谷氨酰胺转胺酶的分离纯化及酶学性质研究

采用离子交换层析和凝胶过滤层析等方法,分离纯化获得了轮枝链霉菌(Streptoverticillium SK4.001)谷氨酰胺转胺酶。同时研究了该酶的酶学性质及反应动力学参数,结果表明,该酶最适反应温度和pH分别为50℃和7.0,温度稳定范围为20-40℃,pH稳定范围为5.6-7.0;Na+,K+,Ca2+,Mg2+,Ba2+不会抑制酶的活性,Zn2+,Fe3+,Cu2+,Pb2+会强烈抑制酶的活性,Mn2+会部分抑制酶的活性,酶的活性部位没有金属离子的参与。以CBZ-Gln-Gly为底物,该酶的Km值为15.81mmol/L,Vmax为16.69μmol/(mL·min)。

谷氨酰胺转胺酶对大豆粉—面粉面团特性的影响

目的：探讨TG对大豆粉-面粉面团加工特性的影响，通过TG的应用提高大豆粉在面制品中的添加量；方法：采用粉质仪、拉伸仪、流变仪测定不同比例大豆粉（7．5％，10％，12．5％，15％，17．5％）的中筋粉或高筋粉面团在添加0．5％TG和不添加TG的情况下搅拌特性、拉伸特性和动态流变学特性；结果：添加0．5％的TG可改善大豆粉和小麦粉面团的流变特性和超微结构，增加面团筋力；结论：添加TG可使面粉中大豆粉的添加量达12．5％～15％。

Streptomyces hygroscopicus谷氨酰胺转胺酶的分离纯化及其性质研究

将新筛选的吸水链霉菌生产的谷氨酰胺转胺酶发酵液抽滤、盐析、离心和冷冻干燥,制得粗酶产品,酶的比活力为5 4 0U/ g ,收率为77 90 %。对粗酶的研究发现,在2 5～4 0℃、pH 6 0～8 0范围内,该酶都有较高的反应活性和稳定性。粗酶经离子交换层析后得到了较高的纯化,纯化倍数为13 1倍,收率6 3% ;再经凝胶过滤层析,酶纯化了1 14倍,收率6 5 % ;经SDS -PAGE电泳检测,得到了单一的区带,根据电泳标准分子量计算,该酶的相对分子质量约为38 32 4ku。