肿瘤坏死因子-α对肠黏膜上皮细胞谷氨酰胺载体功能及其表达的影响

目的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是感染中最重要的调节因子,谷氨酰胺需经过其载体转运至细胞内才能被利用。文中研究TNF-α对肠黏膜上皮细胞株(intestinal epithelial cell line,IEC)-6细胞膜谷氨酰胺载体功能、ASCT2mRNA及蛋白表达的可能影响,揭示TNF-α对细胞膜谷氨酰胺载体功能的影响机制。方法体外培养IEC-6,分为对照组(不与TNF-α共孵育)和实验组(与TNF-α共孵育):实验组与不同剂量的TNF-α(2、5、8、10ng/ml)共孵育2h后,测定细胞[3H]-L-谷氨酰胺摄取率;实验组与5ng/mlTNF-α共孵育不同时段(2、5、8、10h)后,测定ASCT2载体mRNA水平;实验组与5ng/mlTNF-α共孵育不同时段(2、6h)后,检测载体ASCT2蛋白表达水平。结果不同TNF-α剂量孵育的实验组[3H]-L-谷氨酰胺摄取率显著低于对照组(P<0.01),实验组之间差异无显著性意义(P>0.05);孵育2h的实验组ASCT2载体mRNA水平显著高于对照组(P<0.01),时间延长后逐渐下降,10h则与对照组差异无显著性意义(P>0.05);不同时段实验组载体ASCT2蛋白表达水平均显著低于对照组(P<0.01),实验组间差异无显著性意义(P>0.05)。结论TNF-α抑制IEC-6细胞膜谷氨酰胺载体的摄取功能,抑制ASCT2蛋白表达,但不抑制IEC-6细胞ASCT2载体mRNA的表达。TNF-α对细胞膜谷氨酰胺载体功能的抑制可能发生在载体蛋白的翻译或以后水平。

Na^+-依赖性谷氨酰胺载体ASCT2的生物学功能及表皮生长因子的调控作用

目的:Na+-依赖性中性氨基酸载体ASCT2,是一种广谱的氨基酸载体,它的生理功能主要是转运肠腔内谷氨酰胺、丙氨酸、丝氨酸和半胱氨酸等中性氨基酸。本研究拟对ASCT2载体转运特性及表皮生长因子对其的调控机制作一探讨。方法:体外培养Caco-2细胞,观察ASCT2对核素标记谷氨酰胺的转运特性、动力学特征及底物特异性;利用ASCT2多克隆抗体及TaqMan实时定量PCR方法,研究表皮生长因子对ASCT2功能的调控作用。结果:Caco-2细胞中Na+-依赖性3H-L-谷氨酰胺(50μmol)的转运速率为(635±80.1)pmol/(mgprotein·min),大部分中性氨基酸如丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等可对其产生竞争性抑制;在表皮生长因子(100μg/L)孵育下,可以提高其转运活性约100%(P<0.01),Western-blot及real-timePCR显示其蛋白及mRNA表达增高。结论:谷氨酰胺载体ASCT2对核素标记谷氨酰胺具有强大的转运活性,对中性氨基酸底物具有亲和特异性;表皮生长因子对其转运活性、蛋白表达、mRNA丰度具有上调作用。

肝细胞质膜上的谷氨酰胺载体

谷氨酰胺(Gln)是哺乳动物血浆中最丰富的氨基酸,并参与体内多种生理和病理过程。Gln必须首先进出功能细胞,才能发挥其功能,而此过程又必须依赖细胞膜上特异Gln载体的跨膜转运。肝是Gln代谢的主要器官,了解肝细胞质膜Gln载体的结构和功能特性,有助于深入理解Gln的代谢与功能。

早期断奶对仔猪小肠中谷氨酸/谷氨酰胺转运载体表达的影响

本试验旨在研究早期断奶对仔猪小肠中谷氨酸/谷氨酰胺转运载体表达的影响。试验从40头母猪的仔猪中各选出体重相近、10日龄的杜长大三元杂交仔猪1头,共40头仔猪,随机不配对分为2组,每组20头仔猪,对照组为哺乳仔猪,随母猪喂养;试验组为断奶仔猪,隔离断奶饲养。试验期10 d。饲养结束,每组随机选取12头仔猪,屠宰后取空肠和回肠组织,测定谷氨酸/谷氨酰胺转运载体蛋白和mRNA表达情况,并检测小肠组织形态和小肠氧化应激水平。结果表明:与哺乳仔猪相比,早期断奶显著提高了仔猪空肠和回肠谷氨酸/胱氨酸交换载体(xCT)和中性氨基酸转运载体2(ASCT2)蛋白和mRNA表达量(P<0.05);皮尔森相关分析结果显示,断奶仔猪与哺乳仔猪的xCT和ASCT2蛋白表达量在空肠和回肠组织匀浆、细胞内质、细胞顶膜与空肠和回肠中对应mRNA表达量之间均呈正向线性关系,且差异显著(P<0.05)。与哺乳仔猪相比,断奶仔猪空肠和回肠绒毛高度降低,隐窝深度增加,差异均显著(P<0.05)。与哺乳仔猪相比,断奶仔猪空肠和回肠组织的总抗氧化能力均显著降低(P<0.05),且空肠氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量显著提高(P<0.05),回肠谷胱甘肽(GSH)含量显著降低(P<0.05)。结果提示,早期断奶使仔猪小肠处于氧化应激状态,显著提高断奶仔猪小肠组织中xCT和ASCT2蛋白及mRNA表达量,以促进谷氨酸/谷氨酰胺的摄取,降低仔猪小肠的氧化应激水平。

谷氨酰胺转运载体ASCT2在肿瘤中的研究进展

肿瘤细胞具有独特的代谢需求,其代谢过程需要消耗大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺与肿瘤细胞的增殖密切相关,它可以调节细胞的存活、代谢、信号转导、自噬等。丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运载体2(alanine-serine-cysteine transporter 2, ASCT2)是Na^+依赖性的,主要通过跨膜转运谷氨酰胺及一些大分子中性氨基酸。ASCT2在许多肿瘤细胞中都是过度表达的,且ASCT2的高表达与肿瘤患者的不良预后呈正相关。目前国外已将谷氨酰胺的代谢和转运载体作为治疗靶标,进行抗肿瘤新药的研发,但国内对谷氨酰胺转运载体的相关研究报道较少,故本文就ASCT2的结构、表达及在肿瘤中的作用等作一综述。

肿瘤坏死因子-α削弱谷氨酰胺促大鼠骨骼肌蛋白质合成的途径

目的:研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对谷氨酰胺促大鼠骨骼肌蛋白质合成及对细胞膜谷氨酰胺载体ASCT2 mRNA和蛋白表达的影响,揭示TNF-α影响谷氨酰胺促蛋白质合成的途径。方法:30只雄性SD大鼠,随机分为3组:对照组,谷氨酰胺组(Gln组)和谷氨酰胺+肿瘤坏死因子组(Gln+TNF-α组)。所有大鼠均行72 h全肠外静脉营养(TPN)。对照组给予普通TPN;Gln组给予添加丙氨酰谷氨酰胺二肽的肠外营养,谷氨酰胺剂量为0.3 g·kg^(-1)·d^(-1);Gln+TNF-α组TPN方法同Gln组,并于实验结束前24 h持续静脉滴注TNF-α(5μg·kg^(-1)·h^(-1))。所有大鼠均于取材前0.5 h一次性静脉注射L^(-1)5N亮氨酸1.0 mmol/kg。TPN后72 h分别取血和下肢骨骼肌,测定血浆TNF-α浓度(双抗体夹心ELISA法)、血浆和骨骼肌Gln浓度(高效液相色谱分析法)、骨骼肌蛋白质分数合成率(质谱仪测定后计算)、载体ASCT2 mRNA(RT-PCR方法)及蛋白(Western Blot法)表达水平。结果:Gln+TNF-α组血浆TNF-α浓度显著高于其他两组;Gln+TNF-α组血浆及骨骼肌中谷氨酰胺浓度最高;Gln组和Gln+TNF-α组骨骼肌中蛋白质合成率均高于对照组,并且Gln组最高,各组间差异显著(P<0.01)。对照组ASCT2 mRNA表达最低(P<0.01),而另两组间差异无显著性(P>0.05)。3组ASCT2蛋白均有表达,Gln组显著高于对照组和Gln+TNF-α组(P<0.01)。结论:TNF-α能够升高大鼠血浆及骨骼肌中谷氨酰胺的浓度,削弱谷氨酰胺的促蛋白质合成作用;其途径是抑制谷氨酰胺载体蛋白的合成,降低了骨骼肌细胞对谷氨酰胺摄入,导致组织蛋白质合成下降。

肠黏膜上皮细胞的载体分布及功能

目的:谷氨酰胺是肠道细胞的主要氧化燃料,必须通过载体的转运才能进入细胞内。研究IEC-6细胞膜上分布的谷氨酰胺载体种类及其功能。方法:体外培养肠黏膜上皮细胞株IEC-6,检测细胞膜上不同谷氨酰胺载体(ASCT2、SN1、SN2、ATA1、ATA2、LAT1、LAT2)的mRNA;检测载体ASCT2蛋白;测定不同载体对同位素标记谷氨酰胺的转运特性。结果:在IEC-6细胞膜上载体ASCT2、SN1、ATA1、LAT1、LAT2的mRNA均得以表达。细胞外缓冲液中Na+存在时,[3H]-谷氨酰胺摄取率为(164.07±37.94)fmol/(mg protein.10 min);Na+不存在时,[3H]-谷胺酰胺摄取率为(58.71±10.51)fmol/(mg protein.10 min);饱和剂量甲氨基异丁酸(methylamino-isobutyric acid,MeAIB)阻断A类载体后,[3H]-谷氨酰胺摄取率为(81.02±19.59)fmol/(mg protein.10 min)。结论:在IEC-6细胞膜上可能存在载体ASCT2、SN1、ATA1、LAT1、LAT2;Na+依赖性氨基酸载体起主要作用(约64.22%),其中A类载体占50.62%,非A类载体占13.60%,非Na+依赖载体起次要作用(35.78%)

应用RNA干扰技术检测ASCT2功能

目的谷氨酰胺(glutamine,GLN)是肠道细胞的主要氧化燃料,必须通过载体的转运才能进入细胞内,其中载体ASCT2起重要作用,文中将应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术研究肠黏膜上皮细胞株(intestinal epithelial cell,IEC)-6细胞膜GLN载体ASCT2的转运功能。方法体外培养IEC-6,RNAi慢病毒颗粒进行细胞感染,3 d后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达情况,5 d后采用RT-PCR检测载体ASCT2的mRNA表达,7 d后采用Western blot检测其蛋白表达,同时测定[3 H]-L-GLN摄取率。结果病毒转染细胞中均有GFP表达,载体ASCT2的mRNA表达下降60%,蛋白表达几近消失,[3H]-L-GLN摄取率下降15%。结论通过慢病毒载体介导的RNAi这一方便有效的方法,证实了ASCT2载体在整个细胞的GLN转运中起15%以上的作用。