谷氨酰胺酶1在结肠癌中的表达及其对细胞代谢重编程的影响

目的:检测谷氨酰胺酶1(GLS1)在结肠癌和癌旁组织中的表达,并观察干涉GLS1对结肠癌细胞代谢重编程的影响。方法:利用免疫组织化学实验观察50例结肠癌组织芯片中GLS1的表达状态,并进行统计学量化分析;利用siRNA干涉HT29细胞和Caco2细胞中的GLS1后,通过MTT实验、葡萄糖摄取实验和谷氨酰胺摄取实验检测其对细胞生物学行为的影响。结果:GLS1在结肠癌中显著高表达;干涉GSL1后,细胞增殖能力、对葡萄糖和谷氨酰胺的摄取能力均显著下降。结论:GLS1在结肠癌组织中高表达,并且影响细胞对葡萄糖和谷氨酰胺的摄取能力。

谷氨酰胺酶1对卡介苗诱导的巨噬细胞自噬的调控作用

目的:探讨谷氨酰胺酶1(glutaminase 1,GLS1)在卡介苗(Bacille Calmette-Guérin,BCG)感染的巨噬细胞中对自噬的调控作用。方法:培养小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,利用小干扰RNA敲减巨噬细胞内GLS1的表达并结合BCG感染,采用免疫荧光染色、流式细胞术、ELISA和Western blot等技术检测自噬相关指标,阐明GLS1对BCG诱导的巨噬细胞自噬的调控作用,并初步探讨其机制。结果:(1)BCG感染巨噬细胞显著增加了LC3B和GLS1的蛋白表达量(P<0.01),促进了谷氨酰胺分解;(2)敲减GLS1显著增加了巨噬细胞内谷氨酰胺的含量(P<0.05),同时显著降低了巨噬细胞的自噬率以及自噬相关因子LC3B(P<0.01)、beclin-1(P<0.01)和ATG12(P<0.05)的蛋白表达量;(3)剥夺培养液中的谷氨酰胺处理细胞后,敲减GLS1对BCG感染的巨噬细胞中自噬相关因子LC3B、ATG5和ATG12的表达以及自噬流的发生无显著影响。结论:在BCG感染巨噬细胞RAW264.7过程中,敲减GLS1后可通过增加巨噬细胞内的谷氨酰胺含量抑制细胞自噬。

板层状鱼鳞病患者转谷氨酰胺酶1活性缺失及其基因突变

目的检测一板层状鱼鳞病家系中患者转谷氨酰胺酶1的活性及其编码基因的突变。方法以免疫组化法检测患者转谷氨酰胺酶1的活性,PCR扩增该基因的全部编码序列,并行DNA测序。结果患者皮肤转谷氨酰胺酶1的活性完全缺失。PCR结合DNA测序发现患者该基因第4外显子存在异常:第604位碱基由胞嘧啶突变为胸腺嘧啶,使第202位氨基酸由谷氨酰胺(Q)变为终止密码(R202X),导致其编码的蛋白缺失了C端的615个氨基酸。其父母皆为杂合子。结论板层状鱼鳞病患者转谷氨酰胺酶1的活性完全缺失,是其转谷氨酰胺酶1基因的无义突变,引起编码的蛋白缺陷。

干扰谷氨酰胺酶1表达对人胃肠道神经内分泌肿瘤细胞生物学特性的影响

目的观察干扰谷氨酰胺酶1（GLS1）表达对人胃肠道神经内分泌肿瘤细胞生物学特性的影响。 方法Western blot检测GLS1在人胃肠道神经内分泌肿瘤中的表达；将正常对照（NS）-小干扰RNA（siRNA）、GLS1-siRNA1、GLS1-siRNA2、GLS1-siRNA3转染人胃肠道神经内分泌肿瘤细胞株BON-1，未转染任何siRNA的作为对照组，Western blot检测转染后各组细胞中GLS1蛋白表达；细胞计数试剂盒（CCK-8）检测转染12、24、48 h后细胞增殖；细胞转染24 h后，Transwell小室检测细胞侵袭数；Western blot检测基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化mTOR（p-mTOR）、人核糖体蛋白S6激酶（rps6k）、磷酸化rps6k（p-rps6k）蛋白表达；细胞中加入10 nmol/L mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素，检测其对细胞增殖侵袭的影响。 结果GLS1在人胃肠道神经内分泌肿瘤组织中的表达显著高于瘤旁组织（P＝0.000）；GLS1-siRNA1、GLS1-siRNA2、GLS1-siRNA3组细胞中GLS1蛋白表达水平均显著低于对照组，选择GLS1-siRNA2作为后续研究；GLS1-siRNA组在12、24、48 h的细胞存活率为（85.31±4.42）%、（76.12±2.93）%、（69.22±3.62）%，均显著低于对照组[（97.02±2.21）%、（96.61±1.52）%、（97.11±2.32）%；t12 h＝4.104，P12 h＝0.015；t24 h＝10.752，P24 h＝0.000；t48 h＝11.235，P48 h＝0.000]；GLS1-siRNA组细胞侵袭数及MMP-2、MMP-9、p-mTOR、p-rps6k蛋白表达水平均显著低于对照组；加入抑制剂后的细胞增殖及侵袭结果与干扰GLS1表达的结果趋势一致。 结论GLS1在人胃肠道神经内分泌肿瘤中呈高表达，抑制GLS1的表达能显著抑制BON-1细胞增殖和侵袭，其机制与mTOR信号通路的调控有关。

谷氨酰胺酶1在胃癌中的作用和机制探讨

目的谷氨酰胺酶1(GLS1)在胃癌中高表达,通过生物信息学探索GLS1在胃癌中的作用和机制。方法应用多个数据库(包括TIMER,UALCAN和MethPrimer)分析GLS1在胃癌中高表达的原因、GLS1的表达与免疫细胞浸润之间的相关性,实验验证靶向GLS1对于胃癌肿瘤细胞增殖能力的影响。结果生物信息学分析发现:GLS1的高表达与基因突变没有明显的相关性,而与TP53基因突变和启动子区域甲基化有明显的相关性;胃癌中GLS1的表达与多种免疫细胞的浸润明显相关,并且与PD-L1(CD274)和CTLA4的表达呈正相关关系,在一定程度上可以预测PD-L1治疗的疗效;用特异性的siRNA敲低GLS1的表达,可以抑制胃癌肿瘤细胞的增殖,新型GLS1的抑制剂Compound 968可以更好地抑制胃癌肿瘤细胞的增殖。结论GLS1在胃癌中高表达主要是与TP53基因突变和启动子区域甲基化明显相关,胃癌中GLS1的表达与免疫因素密切相关,靶向GLS1可以抑制胃癌肿瘤细胞的增殖能力。

兔抗人谷氨酰胺果糖6磷酸氨基转移酶1(GFPT1)多克隆抗体的制备及应用

目的 制备特异性识别人谷氨酰胺果糖6磷酸氨基转移酶1(GFPT1)的兔多克隆抗体。方法 通过比对GFPT1及其高度同源的同工酶GFPT2的蛋白质序列,针对GFPT1的特异性序列设计并合成2个多肽,多肽与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联作为抗原免疫新西兰大白兔,3次加强免疫后得到抗血清,采用ELISA检测抗血清效价。构建GFPT1和GFPT2的大肠杆菌表达载体,诱导表达获得GFPT1和GFPT2重组蛋白,通过Western blot法检测GFPT1和GFPT2重组蛋白以验证抗血清的特异性、免疫荧光细胞化学染色检测786-O细胞GFPT1的表达验证获得的抗血清能否识别内源性表达的GFPT1。结果 获得了特异性识别GFPT1的多克隆抗体,效价高达1∶1 458 000,该抗体可用于Western blot法以及免疫荧光细胞化学染色。结论 成功制备了特异性识别GFPT1的兔多克隆抗体。

pBabe-GLS1真核表达载体构建及其对结肠癌细胞增殖、谷氨酰胺摄取的影响

目的构建p Babe-GLS1真核表达载体,观察谷氨酰胺酶1(GLS1)对结肠癌细胞增殖及谷氨酰胺摄取的影响。方法运用反转录PCR扩增GLS1基因片段,通过Bam HⅠ和SalⅠ双酶切目的片段并通过T4 DNA连接酶将GLSⅠ基因连接至p Babe真核表达载体中;经Bam HⅠ和SalⅠ双酶切法、PCR法测序鉴定重组DNA分子;转染组将构建的p Babe-GLS1真核表达载体瞬时转染结直肠癌HT29细胞,阴性对照组转染空质粒p Babe,采用Western blotting法检测GLS1蛋白表达,通过谷氨酰胺含量检测试验和蛋白定量实验检测其对结肠癌细胞的生物学影响。结果成功构建了p Babe-GLS1真核表达载体,且在HT29细胞中高表达GLS1蛋白;转染组HT29细胞增殖能力高于阴性对照组(P<0.05),对谷氨酰胺的摄取能力增加(P<0.05)。结论成功构建了p BabeGLS1真核表达载体,构建的p Babe-GLS1真核表达载体能促进结肠癌细胞增殖及谷氨酰胺摄取。

板层鱼鳞病患者指甲内皮蛋白与TGase1酶的表达及其TGM1基因序列分析

目的观察板层鱼鳞病(LI)患者指甲转谷氨酰胺酶1(TGase 1)与内皮蛋白的表达变化,分析其TGM1基因序列。方法分别自8例LI患者(LI组)和8例健康人(C组)的指甲中提取总蛋白进行SDS-PAGE电泳,分别采用免疫印迹及斑点印迹法检测内皮蛋白和TGase 1。对LI组不同家系两个家族的2例患者血液进行TGM1基因序列分析。结果LI组指甲总蛋白SDS-PSGE电泳呈5条主带,即38、48、54、63、69 kDa,而C组仅呈现前4条主带。LI组内皮蛋白主要定位于63、69 kDa主带,C组内皮蛋白仅定位于63 kDa主带。两组内皮蛋白及TGase1的灰度值(GSM)相比,P均<0.05。2例LI患者TGM1基因序列第8、12、13外显子皆有错义的点突变。结论LI患者的指甲内皮蛋白过度表达、TGase 1低表达,TGM1基因序列异常。

抑制谷氨酰胺代谢减轻血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化

本文旨在探讨心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)谷氨酰胺(glutamine,Gln)代谢在高血压所致心肌纤维化中的作用及机制。用微渗透泵给予C57BL/6J小鼠血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ,1.6 mg/kg per d)诱导心肌纤维化,用免疫组织化学法和Western blot检测心肌组织谷氨酰胺酶1(glutaminase 1,GLS1)的表达。小鼠腹腔注射GLS1抑制剂BPTES(12.5 mg/kg)以抑制Gln代谢,用Masson染色法观察心肌纤维化程度,用RT-qPCR和Western blot检测心肌组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达变化。Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠CFs在有/无AngⅡ(0.4μmol/L)刺激下接受Gln 4 mmol/L或BPTES(5μmol/L)处理。用划痕实验和CCK-8法分别检测CFs迁移和增殖,用RT-q PCR和Western blot检测CFs中GLS1、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达变化。在AngⅡ和BPTES处理的条件下,给予CFs 2 mmol/Lα-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)处理,检测CFs迁移、增殖、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达变化。结果显示,AngⅡ诱导的小鼠血压、心脏质量和心肌纤维化均增加,同时心肌组织GLS1表达显著上调。在体外实验中,无论有/无AngⅡ刺激,Gln均可显著促进CFs增殖、迁移及GLS1、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达,而BPTES显著降低CFs上述指标;补充α-KG可逆转BPTES对AngⅡ刺激下CFs的抑制作用。给小鼠腹腔注射BPTES可改善AngⅡ诱导的小鼠心肌纤维化。以上结果提示,Gln的分解代谢在AngⅡ所致心肌纤维化进程中发挥重要作用,靶向抑制Gln分解代谢可能是治疗心肌纤维化的新策略。

GLS1基因调节胃癌细胞迁移、侵袭和EMT的研究

目的研究谷氨酰胺酶1(glutaminase1,GLS1)对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和上皮间充质转化(EMT)的影响。方法体外培养人胃黏膜上皮细胞GES1和胃癌细胞N87、MKN28、BGC826和BGC803。设计合成靶向GLS1的siRNA片段(si-GLS1-1#和si-GLS1-2#),分别转染N87和BGC823细胞,以无意义siRNA为对照(si-con)。采用qRT-PCR检测细胞中GLS1 mRNA表达,CCK8和克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot检测细胞中GLS1蛋白和上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)相关蛋白表达。异种移植瘤实验评估干扰GLS1对胃癌细胞体内生长的影响。结果胃癌细胞中GLS1 mRNA和蛋白均呈高表达(P<0.05)。与si-con组比较,si-GLS1-1#和si-GLS1-2#组细胞中GLS1 mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05)。细胞功能实验结果显示,与si-con组比较,si-GLS1-1#和si-GLS1-2#组细胞的增殖活力、克隆形成能力及迁移、侵袭能力均被抑制(P<0.05),而细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞中N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表达明显升高(P<0.05)。异种移植瘤实验结果显示,与si-con组比较,si-GLS1-1#和si-GLS1-2#组移植瘤体积和重量均明显减小(P<0.05),移植瘤中N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论干扰GLS1能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力及EMT,促进细胞凋亡,抑制胃癌细胞的体内生长。

靶向抑制乳腺癌细胞GLS1基因表达对癌细胞凋亡的影响

目的探讨抑制乳腺癌细胞谷氨酰胺酶(GLS) 1基因表达对癌细胞凋亡的影响。方法参照Lipofectamine^(TM) 2000说明将合成的GLS1 siRNA及无干扰作用的siRNA转染MCF-7细胞,分别为GLS1-siRNA组和阴性对照组,并设置空白对照组,转染48 h后,Western印迹检测GLS1、凋亡相关蛋白survivin、p53及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸激酶(AKT)信号通路PI3K和磷酸化(p-AKT)的蛋白表达; 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测GLS1-siR-NA转染24、48和72 h的细胞活力;流式细胞仪检测GLS1-siRNA转染48 h的细胞凋亡率。结果转染GLS1-siRNA的MCF-7细胞GLS1蛋白表达显著低于空白对照组(P<0. 05);与空白对照组比较,GLS1-siRNA组细胞在转染24、48和72 h的细胞活力均显著降低,细胞凋亡率显著升高,survivin、PI3K和p-AKT蛋白表达均显著降低,p53蛋白表达显著升高(P<0. 05)。结论抑制GLS1基因在乳腺癌中的表达可降低细胞活力,促进细胞凋亡及下调PI3K/AKT信号通路,其中诱导细胞凋亡的方式是下调survivin表达和上调p53表达。

神经酰胺诱导培养角质形成细胞分化的实验研究

目的 : 观察神经酰胺对无血清培养角质形成细胞分化的影响。方法 : 选择两种神经酰胺(C2和C6 ) ,分别添加于无血清培养的角质形成细胞培养液中 ,并在添加后 0、3、6、12、2 4h分别回收总RNA ,用逆转录PCR(RT PCR)方法 ,检测角质形成细胞分化的特异性标记 :TGase1、IVL、KRT1、KRT10等mRNA表达情况。结果 : 神经酰胺添加后 ,C2 神经酰胺对TGase1mRNA、IVLmRNA表达在 12小时均明显上升 ,在 2 4小时分别升高达阴性对照的 5 .7倍和 5 .2倍 ;但C2 神经酰胺对KRT1mRNA和KRT10mRNA表达升高不明显。C6 神经酰胺对TGase1mRNA、IVLmRNA表达大致与C2 神经酰胺相似 ,只是2 4小时表达比C2 神经酰胺降低 ,分别为阴性对照的 3.3倍和 3.5倍 ;但C6 神经酰胺对KRT1mRNA和KRT10mRNA表达显著高于C2 神经酰胺 ,2 4小时分别高达 5 .4倍和 10倍。结论 : 神经酰胺能明显升高无血清培养的角质形成细胞对分化特异性标记蛋白mRNA的表达 ,诱导角质形成细胞的分化。

GLS1在胃癌患者癌组织的表达水平及其与临床预后的关系

目的探讨GLS1在胃癌患者癌组织的表达水平及其对临床预后的预测价值。方法收集88例行手术治疗的胃癌患者组织样本,包括胃癌组织和癌旁组织,采用免疫组织化学检测组织标本的谷氨酰胺酶1型(GLS1)、Raptor、Rictor蛋白表达,实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测组织GLS1、Raptor、Rictor mRNA表达;收集患者临床病理资料,分析GLS1表达水平与胃癌病理资料的关系;对胃癌患者进行随访,分析GLS1表达与患者生存率的关系。结果胃癌组织GLS1蛋白阳性表达率为80.7%(71/88),Raptor阳性表达率为73.9%(65/88),Rictor阳性表达率为88.6%(78/88),癌旁组织分别为38.6%(34/88)、23.9%(21/88)、46.6%(41/88),胃癌组织GLS1、Raptor、Rictor蛋白表达阳性率显著高于癌旁组织(P<0.05)。胃癌组织GLS1、Raptor、Rictor m RNA相对表达量分别为(1.04±0.21)、(1.73±0.32)、(1.32±0.17),均高于癌旁组织(0.65±0.09)、(0.81±0.12)、(0.75±0.11),组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。肿瘤直径>5 cm、低分化肿瘤、Ⅲ~Ⅳ期、合并淋巴结转移、浸润深度为T3~T4者GLS1阳性率明显升高(P<0.05)。GLS1阴性患者3年累积生存率(78.1%)高于阳性患者的3年累积生存率(47.2%),差异有统计学意义(P<0.05)。多因素分析显示,GLS1表达、分化程度、TNM分期是影响胃癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。结论GLS1在胃癌组织表达显著升高,GLS1表达越高,患者预后越差,GLS1可作为胃癌临床预后评估的指标之一。

TGM1基因表达沉默对角质形成细胞分化及角质化包膜形成相关蛋白表达的影响

目的观察转谷氨酰胺酶1基因(transglutaminase 1,TGM1)表达沉默前、后对角质形成细胞的分化及角质化包膜形成相关蛋白表达的影响。方法应用免疫细胞化学SP法和Western印迹法检测RNA干扰(RNAi)技术沉默TGM1基因表达前、后角质形成细胞分化标志物K10、内披蛋白、丝聚蛋白及角质化包膜形成相关的兜甲蛋白和富含脯氨酸的小蛋白(small proline-rich proteins,SPRRs)的表达差异。结果免疫细胞化学检测显示:TGM1沉默后细胞K10、兜甲蛋白和富含脯氨酸的小蛋白呈弱阳性表达或阴性表达,而内披蛋白和丝聚蛋白呈中等阳性表达或强阳性表达;Western印迹法检测结果显示,TGM1沉默后K10、兜甲蛋白和富含脯氨酸的小蛋白的蛋白条带亮度明显降低,而内披蛋白和丝聚蛋白条带亮度与空白对照组和阴性对照组相比没有明显改变。结论 TGM1基因沉默可能通过抑制K10的表达影响表皮细胞分化;通过抑制角质化包膜形成相关蛋白兜甲蛋白和富含脯氨酸的小蛋白的表达影响表皮细胞角质化包膜的形成。

FY-10诱导培养HaCat细胞分化的实验研究

目的：观察FY-10对无血清培养HaCat细胞分化的影响。方法：选择不同浓度的FY-10（10^-5～10^-9mol／L）分别添加于无血清培养的HaCat细胞培养液中，并在添加后24h回收总RNA，用逆转录PCR（RT—PCR）方法检测Hacat细胞分化的特异性标记TGase1、KRT6的mRNA表达情况。结果：FY—10添加后24h能显著的上调TGasel的mRNA的表达，其上调的程度与药物浓度成良好的线性关系；而FY-10对KRT6的mRNA表达呈显著的抑制作用，呈一定的剂量依赖性。结论：一定浓度下FY-10能上调无血清培养HaCat细胞对分化特异性标记蛋白TGase1mRNA的表达，而对KRT6mRNA有下调其表达的作用，促进HaCat细胞的分化，而抑制其增殖。

基于Gln/GLS1/α-KG代谢轴和线粒体凋亡信号通路探讨木瓜总三萜抗D-半乳糖诱导GES-1细胞衰老的作用机制

木瓜总三萜(total triterpenoids from the fruits of Chaenomeles speciosa,TCS)是防治胃黏膜损伤的活性组分,具有潜在的抗衰老作用。然而,TCS是否改善胃衰老,尤其是对于其抗胃衰老的分子机制目前仍不清楚。基于此,该研究旨在探讨TCS对D-半乳糖(D-galactose,D-gal)诱导人胃黏膜上皮细胞GES-1衰老的影响及作用机制,为TCS在临床上用于预防胃衰老提供科学数据。将体外培养的GES-1细胞和转染谷氨酰胺酶1(glutaminase 1,GLS1)过表达(overexpression GLS1,GLS1-OE)质粒的GES-1细胞用D-gal诱导衰老后,给予TCS和谷氨酰胺酶1(glutaminase 1,GLS1)抑制剂bis-2-(5-phenylacetamido-1,2,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide(BPTES),考察各组细胞存活率、衰老标志物β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,SA-β-gal)染色阳性细胞比例、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)和细胞凋亡的变化;采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)法和比色法检测各组细胞上清液和细胞内GLS1活性、谷氨酰胺(glutamine,Gln)、谷氨酸(glutamate,Glu)、α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)、尿素和氨水平;采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测各组细胞中GLS1、线粒体凋亡信号通路相关基因mRNA和蛋白表达情况。结果显示,与D-gal模型组和GLS1-OE D-gal模型组相比,TCS可显著降低D-gal诱导衰老GES-1细胞和GLS1-OE衰老GES-1细胞SA-β-gal染色阳性细胞率和MMP,抑制衰老细胞存活,促进其细胞凋亡(P<0.01),降低上清液和细胞内GLS1活性和Gln、Glu、α-KG、尿素、氨含量(P<0.01),降低线粒体中细胞色素C(cytochrome C,Cyto C)浓度以及细胞中GLS1、增殖细胞核抗原mRNA和蛋白表达(P<0.01),降低细胞中Bcl-2、Bcl-xl mRNA表达和前体半胱氨酸蛋白酶(pro-caspase)-9、pro-caspase-3蛋白表达以及Bcl-2/Bax和Bcl-xl/Bad比值(P<0.01),升高胞质中Cyto C浓度和细胞中Bax、Bad、凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease activating factor 1,Apaf-1)mRNA表达及剪切型半胱氨酸蛋白酶(cleaved-caspase)-9、cleaved-caspase-3、剪切型聚ADP核糖聚合酶-1(cleaved-poly ADP ribose polymerase-1,cleaved-PARP-1)蛋白表达(P<0.01)。以上结果表明,TCS可对抗D-gal诱导GES-1细胞衰老,其作用机制与抑制Gln/GLS1/α-KG代谢轴、激活线粒体凋亡通路,进而促进衰老细胞凋亡、清除衰老细胞密切相关。

板层状鱼鳞病患者指甲和鳞屑内皮蛋白及鳞屑类脂的变化

目的：探讨板层状鱼鳞病（RLI）患者的指甲和鳞屑内皮蛋白和鳞屑类脂的表型改变情况。方法：取5例RLI患者和10例正常人修剪的指甲和表皮鳞屑，行指甲内皮蛋白的免疫印迹、指甲和鳞屑内皮蛋白的免疫组化染色和鳞屑类脂的组织化学染色，利用在图像分析仪对所染色图像进行分析。结果：指甲总蛋白电泳图显示正常人呈现4条主带，RLI呈现5条主带（69000、63000、54000、48000、38000）；免疫印迹显示指甲内皮蛋白表达的相对分子质量主要位于63000～158000范围，其中RLI患者指甲内皮蛋白69000呈过高表达。免疫组化显示RLI患者指甲和鳞屑内皮蛋白表达下凋，组织化学染色显示鳞屑类脂中鳞脂、胆固醇和不饱和脂肪酸含量均降低。结论：RLI患者指甲和鳞屑内皮蛋自和鳞屑类脂分化不良。

Notch信号通路对体外培养小鼠角膜缘上皮细胞黏液素5AC表达的影响

目的通过体外细胞分化模型探讨Notch信号通路对角膜缘上皮细胞分化过程中黏液素5AC(MUC5AC)表达的影响及其临床意义。方法 Western blot检测体外细胞培养24和48h时Notch1、Notch2及Notch3蛋白在小鼠角膜缘上皮细胞中的表达情况;以小鼠体外正常培养角膜缘上皮细胞作为对照组,靶向转染Notch3siRNA的细胞作为实验组,培养24、48和72h后运用Western blot和Real-time PCR检测MUC5AC蛋白及mRNA的表达水平;RT-PCR检测转谷氨酰胺酶1mRNA表达强度变化。结果 Western blot结果显示Notch3蛋白在角膜缘上皮细胞的表达最高,其次是Notch2,Notch1表达不明显。与对照组相比,实验组MUC5AC的蛋白合成及mRNA表达显著下降,其蛋白合成于24、48和72h分别下降了(64.3±35.0)%、(39.5±11.0)%和(41.3±8.3)%;mRNA分别下降了(42.9±14.2)%、(45.0±18.0)%和(46.4±21.0)%;转谷氨酰胺酶1的基因表达明显增强,24、48和72h分别增加了(75.2±11.3)%、(89.7±15.5)%和(101.0±25.0)%。结论 Notch信号通路可影响MUC5AC基因及蛋白合成,对Notch信号的调节可能是治疗黏液素分泌不足型眼表疾病的一个新途径。

芳维A酸氨丁三醇对HaCaT细胞分化的影响

目的观察芳维A酸氨丁三醇作用于无血清培养的HaCaT细胞后,细胞内分化相关基因TGase1表达的变化,探讨其剂量-时间曲线,并比较芳维A酸氨丁三醇与依曲替酸对HaCaT分化的影响。方法将不同浓度的芳维A酸氨丁三醇和依曲替酸(0.001～1.0μm/L)分别加入无血清培养的HaCaT细胞培养液中,在添加芳维A酸氨丁三醇6h、12h和24h后分别回收总RNA,逆转录PCR(RT-PCR)法检测HaCaT细胞分化的特异性标记基因TGase1 mRNA的表达情况;芳维A酸氨丁三醇和依曲替酸分别在孵育24h后回收总RNA,用RT-PCR法检测TGase1 mRNA的表达,比较这两种药物对HaCaT细胞分化的差异。结果0.001～1.0μm/L浓度的芳维A酸氨丁三醇作用于HaCaT细胞6h、12h和24h后能显著促进HaCaT细胞内分化基因TGase1mRNA表达,且呈剂量和时间依赖性(P<0.05)。芳维A酸氨丁三醇及依曲替酸都可促进TGase1 mRNA表达,且TGase1mRNA的表达呈剂量依赖性,这两种药物的剂量曲线非常相似,其促进TGase1 mRNA表达程度比较,差异无显著性意义(P>0.05)。结论芳维A酸氨丁三醇能显著促进HaCaT细胞内分化基因TGase1 mRNA的表达,且呈时间和剂量依赖性,其促进HaCaT细胞分化的作用与依曲替酸的效果类同。