大鼠神经系统内谷氨酸受体2/3亚型的定位分布

用特异性抗体的免疫细胞化学染色技术观察谷氨酸受体 2 / 3亚型 (GluR2 / 3)在大鼠神经系统的定位分布。结果显示GluR2 / 3样阳性神经元主要分布于大脑皮质、尾壳核、苍白球、隔核、海马CA1～CA4区、齿状回、乳头体、小脑Purkinje细胞层、动眼神经核、滑车神经核、臂旁核、三叉神经运动核、上橄榄复合体、三叉神经脊束核、面神经核、疑核、迷走神经背运动核、舌下神经核、楔束核、薄束核、延髓和脊髓背角I～Ⅱ层、背根节、三叉神经节等。本研究结果表明GluR2 / 3样阳性结构广泛分布于大鼠神经系统 ,为Glu发挥兴奋效应提供了作用位点。

电针对急性心肌缺血大鼠海马谷氨酸系统的影响

目的 观察电针对急性心肌缺血(AMI)大鼠海马谷氨酸(Glu)、代谢型谷氨酸受体2/3(mGluR2/3)和凋亡相关蛋白表达的影响,探讨电针抗AMI的作用机制。方法 50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组和抑制剂组,每组10只。除假手术组外,其余各组采用左冠状动脉前降支结扎法建立AMI大鼠模型。电针组于双侧“神门”“通里”予电针刺激,30 min/次,1次/d,连续3 d;抑制剂组于造模后30 min经侧脑室注入mGluR2/3抑制剂LY341459。HE染色观察心肌组织形态,ELISA检测心肌组织胱天蛋白酶-3(Caspase-3)活性和海马组织Glu含量,免疫荧光染色检测海马组织mGluR2/3表达,TUNEL染色检测海马组织细胞凋亡情况,Western blot检测海马组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和Caspase-3蛋白表达。结果 与假手术组比较,模型组大鼠心肌细胞稀疏、肿胀,炎性细胞浸润严重;心肌组织Caspase-3活性显著升高,海马组织Glu含量、mGluR2/3阳性表达及凋亡细胞数均显著增加(P<0.01),海马组织PI3K、Akt蛋白表达显著降低,Caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,电针组和抑制剂大鼠心肌细胞水肿减轻,炎性细胞浸润减少,心肌组织Caspase-3活性显著降低,海马组织Glu含量、mGluR2/3阳性表达及凋亡细胞数均显著减少(P<0.01),海马组织PI3K、Akt蛋白表达显著升高,Caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论 电针可改善AMI大鼠心肌损伤,其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路,进而抑制海马组织mGluR2/3过度表达、减少Glu蓄积、抑制海马神经细胞凋亡,减轻神经毒性有关。

大鼠单侧耳蜗损伤后蜗核中GluR2/3受体表达的变化

目的观察单侧耳蜗损伤后不同时段α-氨基-3-羧基-5-甲基异唑-4-丙酸(alpha-amino-3-hydoxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate,AMPA)受体亚型谷氨酸受体2/3(glutamate receptor2and3,GluR2/3)在大鼠耳蜗核的表达的变化,为外周损伤后听觉中枢重组的分子机制提供可能的实验依据。方法手术破坏耳蜗各回,制造单侧耳蜗损伤模型;FITC标记免疫组织化学方法检测损伤后2、4、6、8、12、24h和3、7d的GluR2/3亚型在SD大鼠听觉中枢中的表达。结果①损伤后各组健侧GluR2/3受体表达的强弱各组间以及与对照组无显著性差异;②术后2h即可观察到术侧蜗核胞浆中受体表达增强,6h达到高峰,以后逐渐减弱,至第3d时低于正常水平;③正常对照组和健侧的蜗核中,GluR2/3受体主要分布在胞膜,膜周胞浆和突触上;而术侧蜗核中GluR2/3大都分布在胞浆中,胞膜上表达减弱。结论单侧耳蜗损伤后可导致术侧蜗核中GluR2/3在胞膜上的表达降低。

大鼠单侧耳蜗损伤后下丘中GluR2/3受体的变化

目的观察单侧耳蜗损伤后短时间内谷氨酸受体2/3(glutamate receptor 2 and 3,GluR2/3受体)在大鼠下丘的表达变化,为探讨外周损伤后听觉中枢重组的分子机制提供参考。方法36只大鼠随机分为9组,分别为耳蜗损伤造模后2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、3 d、7 d及正常对照组,每组4只,前8组动物用手术方法制造单侧耳蜗损伤模型,正常对照组不做处理,造模完成后于相应时间点采用FITC标记免疫组化方法检测各组GluR2/3受体在下丘的表达变化。结果GluR2/3受体主要位于胞膜及膜周胞浆中,胞核周弱表达或无表达;造模术后不同时间各组术侧下丘中GluR2/3受体相对灰值比较,术侧与健侧比、手术组与对照组比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论大鼠单侧耳蜗损伤7天内术侧下丘中GluR2/3表达未见明显差异。

GluR2/3受体在不同年龄大鼠背侧蜗神经核的表达

目的研究α-氨基羟甲基恶唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid,AMPA)受体亚型GluR2/3(Glutamate recptor 2/3)在不同周龄大鼠蜗神经核的表达。方法用免疫组化方法检测GluR2/3亚型在不同年龄(1～16周)SD大鼠(Sprague-Dawlay rat)背侧蜗神经核中的表达,免疫电镜技术检测其在细胞内的定位。结果1周龄大鼠蜗神经核中无明显表达,2周时开始出现该受体的表达,3周时亦有极少量表达,4周时表达有明显增加,以后依次递增,至9周时表达最强,以后逐渐下降,并稳定于16周。各周龄受体均表达于包膜及胞浆中。电镜下(6周、10周)时见胶体金主要沉积于线粒体,部分可见于粗面内质网及胞浆。结论出生后GluR2/3在蜗神经核的含量随年龄变化而变化,这种改变可能与听觉发育及可塑性相关。

运动通过上调mGluR2/3表达抑制帕金森病模型大鼠纹状体中等多棘神经元异常电活动

目的:探讨运动通过上调代谢型谷氨酸受体2/3(mGluR2/3)表达对帕金森病(PD)模型大鼠纹状体中等多棘神经元(MSNs)异常电活动的影响。方法:清洁级SD大鼠随机分为假手术安静组(Control组,n=9)和6-羟基多巴胺(6-OHDA)造模组(6-OHDA组,n=40)。6-OHDA造模组采用神经毒素6-OHDA注射于大鼠右脑内侧前脑束(MFB),建立偏侧损毁PD模型大鼠,假手术组于相同部位给予同等剂量的生理盐水作为对照组。采用阿扑吗啡(APO)诱导旋转行为测试评价PD模型的可靠性。经鉴定符合PD模型的大鼠随机分为6-OHDA安静组(PD组,n=9)、6-OHDA+运动组(PD+Ex组,n=9)和6-OHDA+运动+mGluR2/3拮抗剂组(PD+Ex+APICA组,n=9)。运动组于手术后1周开始进行跑台训练干预(11 m/min,30 min/day,5 d/week,4 weeks)。运动+mGluR2/3拮抗剂组每次运动前,采用微量注射泵将mGluR2/3拮抗剂APICA注射到纹状体内,注射体积为1μL。采用免疫组织化学染色技术检测黑质酪氨酸羟化酶(TH)免疫阳性细胞数量和纹状体TH免疫阳性纤维终末含量。采用免疫印迹技术检测纹状体mGluR2/3的表达水平。采用多通道电生理记录系统对各组大鼠清醒静止状态下纹状体神经元电活动进行记录。结果:APO诱导的旋转行为测试和TH免疫组织化学检测结果表明,PD大鼠模型可靠,成模率为67.5%。免疫印迹技术检测结果显示,与Control组相比,PD组纹状体mGluR2/3表达水平显著下调(P<0.01);与PD组相比,PD+Ex组纹状体mGluR2/3表达水平显著上调(P<0.05)。电生理分析结果表明,与Control组相比,PD、PD+Ex和PD+Ex+APICA组纹状体MSNs平均放电频率均显著增加(P<0.01);与PD组相比,PD+Ex组纹状体MSNs平均放电频率显著降低(P<0.05);与PD+Ex组相比,PD+Ex+APICA组纹状体MSNs平均放电频率显著增加(P<0.01)。与Control组相比,PD组纹状体神经元局部场电位(LFPs)在β频段(10~30 Hz)节律性振荡功率出现异常增加(P<0.01),PD+Ex组纹状体神经元LFPs在β频段(10~30 Hz)节律性振荡功率较PD组显著降低(P<0.05),PD+Ex+APICA组纹状体神经元LFPs在β频段(10~30 Hz)节律性振荡功率较PD+Ex组异常增加(P<0.01)。与Control组相比,PD组动作电位(spike)在β频段(10~30 Hz)诱发的LFP波形平均(STWA)值显著升高(P<0.01);与PD组相比,PD+Ex组STWA值显著降低(P<0.05);与PD+Ex组相比,PD+Ex+APICA组STWA值显著升高(P<0.01)。结论:PD模型大鼠纹状体MSNs兴奋性显著增加,LFPβ频段节律性振荡的功率显著增加,spike与LFPβ频段节律性振荡的同步化程度显著增加;运动干预可使PD模型大鼠纹状体MSNs兴奋性、LFPβ频段节律性振荡的功率以及spike与LFPβ频段节律性振荡的同步化程度均显著降低;纹状体微量注射GluR2/3拮抗剂可使运动的积极效应消失,进一步证实mGluR2/3在PD模型大鼠纹状体MSNs运动依赖可塑性中发挥了重要作用,并将成为PD治疗药物研发的新的靶向分子。

1,3-二氢苯并[b][1,4]二氮杂卓-2-酮类非竞争性mGluR2/3拮抗剂的三维定量构效关系

目的本研究采用比较分子力场分析法(comparative molecular field analysis,CoMFA)和比较分子相似性指数分析法(comparative molecular similarity indices analysis,CoMSIA),系统研究了30个1,3-二氢苯并[b][1,4]二氮杂卓-2-酮类非竞争性代谢型谷氨酸受体2/3(mGluR2/3)拮抗剂的三维定量构效关系。方法通过考察网格点步长对CoMFA研究统计结果和各种分子场组合、网格点步长和衰减因子对CoMSIA研究统计结果的影响,建立了3D-QSAR模型,发现立体场、静电场、疏水场和氢键受体场的组合可得到最佳模型。结果所建立的CoMFA和CoMSIA模型的交叉相关系数q2值分别为0.729和0.713,均具有较强的预测能力。结论利用CoMFA和CoMSIA模型的三维等值线图直观地解释了化合物的构效关系,阐明了化合物结构与生物活性的关系,为进一步结构设计和优化提供了重要依据。

左归降糖解郁方调控Glu-mGluR_(2/3)-PI3K信号通路在糖尿病并发抑郁症海马NVU神经元凋亡中的保护作用

目的:探讨左归降糖解郁方调控Glu-mGluR_(2/3)-PI3K信号通路在糖尿病并发抑郁症(DD)海马神经血管单元(NVU)中神经元凋亡的保护作用及其机制。方法:原代分离、纯化和培养SD大鼠海马神经元(Ne)、星形胶质细胞(As)与脑微血管内皮细胞(Bm),并对其进行免疫细胞化学染色鉴定;采用Transwell小室及高糖联合皮质酮干预构建DD海马NVU细胞模型;实验设正常对照组、模型对照组、10%空白血清对照组、mGluR_(2/3)激动剂5μmol/L组、PI3K阻断剂2μmol/L组、左归降糖解郁方32.8 g/kg 10%含药血清组。造模及给药18 h后,采用CCK8法检测NVU中海马神经元细胞存活力,采用ELISA法检测NVU中海马神经元细胞上清液谷氨酸(Glu)含量;采用免疫荧光联合高内涵细胞成像(HCA)分别检测NVU中AS细胞内代谢型谷氨酸受体2/3(mGluR_(2/3))蛋白表达水平和海马神经元细胞内的细胞外调节蛋白激酶(ERK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、半胱天冬酶-9(Caspase-9)蛋白表达水平;采用Tunel染色NVU中海马神经元细胞凋亡水平。结果:与正常对照组比较,模型对照组海马神经元细胞存活率显著降低(P<0.01),细胞上清液中Glu含量显著升高(P<0.01),AS细胞内mGluR_(2/3)蛋白表达显著上调(P<0.01),Ne细胞内ERK、Casepase-9蛋白表达明显上调、PI3K蛋白表达明显下调(P<0.05或P<0.01),海马神经元细胞凋亡显著增加(P<0.01);与模型对照组比较,左归降糖解郁方32.8 g/kg 10%含药血清组海马神经元细胞存活力显著增加(P<0.05),Glu含量显著降低(P<0.05),mGluR_(2/3)、ERK、Casepase-9蛋白表达显著下调,PI3K蛋白表达明显上调(P<0.05或P<0.01),海马神经元细胞凋亡数量显著下降,且核固缩、染色质浓染等阳性特征明显减轻。结论:左归降糖解郁方可调控mGluR_(2/3)活化介导的Glu-mGluR_(2/3)-PI3K信号通路异常,这可能是其抑制糖尿病并发抑郁症海马神经元凋亡的重要机制。