温度对水稻谷氨酰胺合成酶和NADH-谷氨酸合酶表达的影响

测定了不同温度（32℃和23℃）培养下水稻幼苗根和叶的谷氨酰胺合成酶（GS）同工酶以及依赖于NADH的谷氨酸合酶（NADH-GOGAT）的活性变化.结果表明,温度对水稻根和叶的GS活性具有相反的作用.23℃下生长的水稻根的GS活性明显高于32℃下生长的活性,而23℃下生长的叶的GS活性显著低于生长在32℃下的叶的活性.Native-PAGE和活性染色以及蛋白质印迹表明,根和叶的GS活性变化主要是由于GSrb和GS2活性及其相应蛋白质水平变化所致.23℃下生长的水稻根的NADH-GOGAT活性显著高于32℃下生长的活性,而叶的活性则基本保持恒定.

NaCl对水稻谷氨酸合酶和谷氨酸脱氢酶的胁迫作用

在 Na Cl的胁迫下 ,水稻幼苗根和叶的谷氨酸合酶和谷氨酸脱氢酶的活性随着营养液中的 Na Cl浓度的升高而降低 ;游离 NH+ 4 在叶中积累 ,在根中未见明显变化。与根相比 ,叶对 Na Cl的胁迫作用更为敏感。叶的 NADH- GOGAT和 NADH- GDH活性在 Na Cl胁迫下降低的程度明显大于根。无论是否有 Na Cl存在 ,根的 NADH- GDH活性明显高于叶。 GS/GDH比值分析提示 ,在对照下 ,根中的 NH+ 4 的同化以 GS- GOGAT途径为主 ;而在 Na Cl胁迫下 ,GS- GOGAT途径明显削弱 ,GDH途径在 NH+ 4 的同化中的作用明显加强。无论是否有 Na Cl的存在 ,叶的 NH+ 4 同化途径都是以 GS- GOGAT为主。

浑球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)谷氨酸合酶的纯化及性质

浑球红假单胞菌菌株601经超声击碎,粗提液通过Triton处理,硫酸铵沉淀,DE—52和DEAE—sephadex A—50柱层析及 Seqhadex G—200凝胶过滤等步骤,将谷氨酸合酶(GOGAT)分离纯化,在聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现一条带。GOGAT表观分子量约为138 kD。该酶最大光吸收在278,375,450 nm和475 nm处,表明GOGAT可能是一种黄素蛋白。纯化的GOGAT对其底物 Gln,α—酮戊二酸和NADPH的表观K_m值分别为830,150和6μmol/L。反应产物Gln和NADP,几种氨基酸对GOGAT活力有不同程度的抑制作用,Gln类似物DON对GOGAT活力有强烈的抑制作用。

浑球红细菌谷氨酸合酶基因(glt)的克隆和图谱分析

利用转座子Tn5随机插入诱变筛选得到12株浑球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)氨同化缺陷突变株(Asm^-)。这些突变株胞内均无GOGAT活性,同时它们均无固氮酶活性(Nif^-),并且具有氮代谢多效性缺失表型(Ntr^-)。将含有Azorhizobium sesbaniae ORS571的完整glt基因的质粒pHB10转入突变株中能互补上述表型。通过筛选携带Tn5的R-prime质粒克隆了glt::Tn5片段。Southern杂交证明所克隆glt::Tn5片段与E. coli的gltBD基因有同源性。用此片段与以pLAFR3为载体所构建的R. sphaeroides 601基因文库进行菌落原位杂交筛选到了携带glt基因的cosmid pLT27。pLT27能互补所有12株R.sphaeroides氨同化缺陷突变株。酶切分析表明在该cosmid中插人的染色体DNA片段大小约为26.5kb。以pRK415为载体亚克隆了4.0kb与10.5kh的pLT27的Hindlll酶切片段,分别命名为pLTRK271与pLTRK272。pLTRK272能互补变种GT6、GT10、GT11,pLTRK271能互补其余的变种。通过单、双酶切作出了pLTRK271与pLTRK272的物理图谱。上述10.5kb的pLT27Hindlll酶切片段与E. coil gltBD基因具有同源性。Southern杂交分析表明Tn5均插在变种染色体的同一区域并得出了其插入位点。由此可确定glt基因大致位于一段11kb的EcoRl-Hindlll克隆片段内。

水稻种子萌发期间谷氨酰胺合成酶和NADH-谷氨酸合酶的变化

测定了水稻种子不同萌发时期胚乳、胚芽鞘和幼根的谷氨酰胺合成酶 (GS)和依赖于NADH的谷氨酸合酶 (NADH GOGAT)活性变化。胚乳和胚芽鞘的GS活性在萌发过程中升高 ,幼根的GS活性则有所降低。NADH GOGAT的活性变化趋势与GS相同。Native PAGE活性染色表明 ,在萌发阶段的水稻种子胚乳和幼根里 ,始终只观察到一种GS活性带。但是 ,在水稻种子萌发 3d后 ,在胚芽鞘中除继续检测到GS1的活性外 ,还可以观察到GS2的活性。蛋白质印迹显示 ,水稻种子胚乳中的GS(GSe)与GS1和GSra一样是一种胞质型GS。实验结果提示 ,这些不同组织中的GS与NADH

浑球红细菌谷氨酸合酶大亚单位基因(gltB)的序列分析

测定了浑球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)谷氨酸合酶大亚单位基因(gltB)及其5'端和3'端的序列,全长为5510bp。序列分析表明,R. sphaeroides gltB基因全长为4636bp。从核苷酸序列推测其蛋白质分子量约为164kD。R. sphaeroides gltB基因与Azospirillum brasilense和Escherichia coli的gltB基因DNA序列有很高的同源性。其蛋白质氨基酸序列与A. brasilense gltB基因产物GltB也具有很高的同源性。此外,还对R. sphaeroides GltB的各可能功能区进行了分析,发现它们具有很高的保守性。

谷氨酸合酶在灵芝中生物学功能的研究

[目的]通过对谷氨酸合酶(glutamate synthase,GOGAT)的基因序列进行预测和分析,构建谷氨酸合酶基因的沉默转化子,验证谷氨酸合酶在灵芝吸收、利用氮源、生长及次级代谢中的作用。[方法]利用真菌中已报道的谷氨酸合酶基因,在灵芝基因组库中分析比对得到灵芝中可能的谷氨酸合酶基因。通过构建进化树和结构域分析及酶活性测定,确定灵芝谷氨酸合酶序列。随后利用RNA干扰技术,将灵芝的GOGAT基因进行沉默,研究GOGAT对灵芝生长及次级代谢的影响。[结果]获得灵芝谷氨酸合酶序列,该酶具有保守的谷氨酸合酶结构域,并且在进化上高度保守。在4种氮源(谷氨酰胺、铵盐、脯氨酸和硝酸盐)条件下检测谷氨酸合酶活性和基因转录水平,野生菌株中的GOGAT比酶活和转录水平在不同氮源条件下没有显著变化。通过RNA干扰方法,获得沉默效率分别为(77.0±1.9)%和(77.5±2.0)%的GOGAT沉默菌株2株。平板试验表明,将GOGAT沉默后,灵芝菌丝的生长受到一定程度的抑制。在硝酸盐培养条件下,相比于野生菌株,GOGAT沉默菌株基本停止生长;而在脯氨酸存在条件下,2株沉默菌株的生长直径分别降低(16.0±1.9)%和(21.0±1.3)%。进一步检测灵芝三萜含量发现,当使用铵盐或脯氨酸作为唯一氮源培养时,相比于对照菌株,GOGAT沉默菌株中的灵芝三萜含量分别降低(32.1±4.5)%和(11.0±1.1)%;而以谷氨酰胺和硝酸盐培养时,各菌株中的灵芝三萜含量没有显著变化。[结论]本研究获得了灵芝中合成谷氨酸的重要酶基因GOGAT,发现其对灵芝的生长及次级代谢十分重要。

抑制表达谷氨酸合酶基因对水稻碳氮代谢的影响

提高水稻的氮素利用率对农业生产极为重要,水稻谷氨酸合酶(GOGAT,EC1.4.1.14)被认为具有提高水稻氮素利用率的潜力,但该酶在水稻中的功能以及其对碳氮代谢的影响一直未被系统的报道.本研究以抑制表达谷氨酸合酶基因的转基因水稻为材料,结合谷氨酸合酶基因家族全生育期表达谱数据,研究该基因家族在水稻体内的功能及其对碳氮代谢的影响.结果表明,谷氨酸合酶家族基因成员的表达模式各不相同,具有明显的组织和器官特异性,表明其在体内行使着不同的功能.与野生型相比,抑制表达谷氨酸合酶基因的转基因植株的分蘖数、地上部干重以及单株产量显著下降.同时,转基因植株叶片中的硝酸盐、部分游离氨基酸、叶绿素、糖、糖磷酸以及吡啶核苷酸含量也显著降低,但游离铵、α-酮戊二酸以及异柠檬酸含量上升.分析表明,谷氨酸合酶在水稻的碳氮代谢过程中扮演着重要角色,是水稻氮素高同化过程中必不可少的因子.

林肯链霉菌谷氨酸合酶的纯化和性质

采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、凝胶过滤和吸附层析等方法 ,分离纯化了林肯链霉菌谷氨酸合酶 ,电泳鉴定为单一组分 .这是链霉菌中的第 1例 .谷氨酸合酶很不稳定 ,向酶缓冲液中加入α KG ,PMSF ,EDTA ,β 巯基乙醇和甘油可以大大提高其稳定性 .测得全酶分子量为 1 38ku ,亚基分子量为 81和 5 7ku ,表明该酶由2个不相同的亚基构成 .吸收光谱在 380和 440nm附近没有吸收峰 ,表明该酶是不含铁的非黄素蛋白质 .该酶反应的最适 pH为 7 2 ,最适温度为 30℃ .该酶对NADH ,α KG和L Gln的表观Km 值分别为 5 2 1× 1 0 -5 ,4 1 7× 1 0 -4 和 4 35× 1 0 -4mol/L .以NADPH代替NADH作电子供体 ,该酶仍表现出部分活力 .反应产物Glu和NAD+,部分金属离子、氨基酸及三羧酸循环中间物对该酶活力有不同程度的抑制作用 .

敲除aceA和gogat及过表达gltA对谷氨酸棒状杆菌GKGD合成α-酮戊二酸的影响

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)在生命活动中具有重要的作用,被广泛应用于食品、医药等领域。以α-KG生产菌谷氨酸棒状杆菌GKGD为出发菌株,敲除其异柠檬酸裂解酶编码基因ace A以增加异柠檬酸供应,获得GKGD-1,摇瓶发酵条件下其α-KG产量和转化率分别提高14.72%和9.76%;敲除谷氨酸合酶编码基因gogat以降低L-谷氨酸生成量,获得GKGD-2,其α-KG产量和转化率分别提高7.39%和5.43%,L-谷氨酸生成量降低52.87%;过表达柠檬酸合酶编码基因glt A以进一步增加前体物供应,获得GKGD-3,其α-KG产量提高35.9%;于7.5 L发酵罐经30 h发酵,GKGD-3α-KG产量达49.5 g/L,较出发菌株提高36.4%,L-谷氨酸生成量降低50%。敲除ace A和gogat并过表达glt A可显著提高α-KG产量并降低L-谷氨酸生成量。

不同形态氮素对专用型小麦花后氮代谢关键酶活性及籽粒蛋白质含量的影响

采用盆栽方法研究了氮素形态对不同专用型小麦开花后氮素同化关键酶活性及籽粒蛋白质含量的影响。结果表明:不同专用型小麦氮素同化关键酶硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶对氮素形态的反应不同。强筋小麦豫麦34施用酰胺态氮对旗叶硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性、籽粒谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶活性具有明显的促进作用,最终籽粒蛋白质含量较高;中筋小麦豫麦4 9在施用铵态氮时,3种氮素同化关键酶活性均有较大增强,籽粒蛋白质含量最高;弱筋小麦豫麦5 0硝酸还原酶活性以铵态氮处理最高,而籽粒和旗叶谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶活性在酰胺态氮处理下明显增强,酰胺态氮对籽粒中蛋白质含量的增加具有明显的促进作用。相关性分析表明,籽粒蛋白质含量与旗叶GS活性和籽粒GOGAT活性呈显著或极显著正相关,与旗叶NR活性和GS活性。

水稻氮素同化关键酶活性与叶色变化的关系

【目的】明确水稻叶色变化的内在生理机制。【方法】采用无氮肥和常规氮肥两个处理的水培试验,测定水稻地上部不同叶位叶片叶色值、叶绿素含量及氮素同化关键酶活性的变化。【结果】在氮饥饿和常规施肥条件下,水稻地上部不同叶位的叶色具有明显的黑黄变化规律。氮饥饿处理剑叶抽出前不同叶位叶片叶色值基本上表现为顶二叶>顶一叶>顶三叶,剑叶抽出后表现为顶一叶>顶二叶>顶三叶。不同叶位叶片GS、GOGAT活性分别在拔节期、剑叶抽出期出现两次高峰,各叶位的叶片GS、GOGAT活性基本表现为顶二叶>顶一叶>顶三叶。不同叶位叶片的GOGAT活性与当周叶片的SPAD值、叶绿素a、叶绿素b及叶绿素(a+b)含量均呈显著或极显著相关。常规施肥处理条件下水稻叶色及酶活性在整个生育期变化趋势与氮饥饿处理相似,GS酶活性与酶活性测定一周后的叶色关系非常密切,GOGAT活性与顶三、四叶叶色呈显著负相关,与酶活性测定1周后顶二、顶三叶的叶绿素a含量、2周后顶二、顶三叶的叶绿素(a+b)含量及2周后顶二叶的叶绿素b含量也呈显著正相关。【结论】水稻叶色变化是一个复杂的生理生化代谢过程,水稻不同叶位叶片叶色及氮素同化关键酶GS、GOGAT酶活性均具有明显的高低变化,氮素同化关键酶活性高低与叶绿素的合成及叶色变化具有密切的因果关系,在叶绿素的合成和叶色形成过程中具有一定作用。水稻叶色黑黄变化是一个受内生节奏制约的生物学过程,氮素水平对叶色深浅具有一定的调节作用,但不能改变内生黑黄变化节奏。

盐碱胁迫对甜菜氮代谢相关酶活性及产量和含糖率的影响

利用KWS0143和ACERO为试验材料,比较盐碱(碳酸钠)胁迫对2个甜菜品种氮代谢关键酶活性及产量和含糖率的影响,旨在进一步明确甜菜对盐碱胁迫的适应性。通过桶栽试验,设5个处理,分别是碳酸钠占土壤质量百分比0、0.5%、1%、1.5%和2%,对应的土壤溶液p H值分别为7.14、8.92、9.45、10.19、10.56。研究盐碱胁迫对甜菜叶片硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT)活性及产量和含糖率的影响。结果表明,盐碱胁迫使甜菜叶片的硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)及谷氨酸合酶(GOGAT)活性均下降,且随着盐碱胁迫程度的增大,下降幅度增大。两品种比较,ACERO的酶活性高于KWS0143,且ACREO的块根产量和含糖率下降的幅度低于KWS0143,ACREO比KWS0143具有较强的耐盐碱能力。该研究为进一步提高盐碱胁迫下甜菜对氮素的吸收利用效率理论依据。

不同氮源对水稻幼苗根氨同化酶的影响

将氮素含量相同、但来源不同的氮源分别加入到水稻培养液中 ,分析了不同氮源对水稻幼苗根氨同化酶活性的影响 .与无氮培养的水稻根相比 ,( NH4) 2 SO4,NH4NO3,KNO3,谷氨酸 ( Glu)和谷氨酰胺 ( Gln)都能分别促进水稻根谷氨酰胺合成酶 ( GS)、依赖于 NADH的谷氨酸合酶 ( NADH- GOGAT)和依赖于 NADH的谷氨酸脱氢酶 ( NADH- GDH)活性 .( NH4) 2 SO4对 GS和 NADH- GOGAT活性促进最为显著 ,而 Gln对 GS和 Glu对 NADH-GOGAT的活性分别影响最小 .Glu对 NADH- GDH活性的诱导稍强于其它氮源 .这些结果提示 。

甜瓜子叶发育过程中蛋白质水平和氨同化酶活性变化

测定了甜瓜种子萌发和子叶发育过程中谷氨酰胺合成酶 (GS)、依赖于NADH的谷氨酸合酶 (NADH GOGAT)、依赖于NADH的谷氨酸脱氢酶 (NADH GDH)等酶的活性变化以及种子萌发时可溶性蛋白水平的变化 .在有氮或无氮下 ,在子叶刚出土时GS和NADH GOGAT活性较低 ,随着子叶的发育 ,这两种酶的活性升高 ,两者分别于第 7天和第 5天达到最高 ,其后活性逐步降低 .但是NADH GDH呈现出相反的变化 ,在子叶发育的前期阶段其活性低 ,而后逐步升高 .可溶性蛋白的含量随着子叶的发育而逐步降低 .

壳聚糖对不结球白菜叶片氮代谢关键酶的调节作用

研究了壳聚糖(chitosan)对氮代谢关键酶[谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT)和谷氨酸脱氢酶(GDH)]和可溶性蛋白质含量的影响。结果表明:0.8mg·mL^(-1)壳聚糖溶液喷洒不结球白菜叶片后,GS对NH_4^+的K_M值增大,而GDH对NH_4^+的K_M值变小;在酶活性检测中,GS比活性受到了抑制,而GDH比活性则被提高,GOGAT比活性则表现为先上升后下降;削弱了不结球白菜叶片中的氨同化过程的GS-GOGAT途径,加强了GDH途径;同时,提高了叶片可溶性蛋白含量。

不同耐盐性水稻幼苗根氨同化酶对盐胁迫的反应

在盐胁迫下，检测了耐盐性不同的水稻(Oryza sativa L．)品种根部氨同化酶及其相关参数的变化。结果表明，根的可溶性蛋白、谷氨酰胺合成酶(Gs)及依赖于NADH的谷氨酸合酶(NADH-GOGAT)活性在高盐浓度下不同程度地降低，其影响大小依次为早花二号(盐敏感品种)、金珠一号(正常栽培品种)、津稻779(耐盐品种)，与其耐盐性相一致。在盐胁迫条件下，在耐盐性较高的水稻品种中，GS和GOGAT活性比盐敏感品种高，NH4+浓度维持在较低的水平。Native-PAGE和活性染色结果表明，GSrb更容易受到外界环境的影响。在高浓度盐的胁迫下，早花二号、金珠一号的依赖于NADH的谷氨酸脱氢酶(NADH-GDH)活性都有较显著的升高，津稻779却无明显的变化，这和NH4^+含量的变化相一致。盐不同程度地导致可溶性糖(TSS)在金珠一号和津稻779根部积累，而在早花2号的根部，可溶性糖的水平则随盐浓度的不同而表现出不同的变化。在所检测的品种中，脯氨酸的含量均有不同程度的升高，但在高盐浓度下，盐敏感品种的含量较低。这些结果提示，不同的水稻品种对盐胁迫的敏感程度与该品种GS以及GOGAT活性的高低有关。

高等植物中氨同化酶及其同工酶研究

介绍了高等植物中谷氨酰胺合成酶及其同工酶的分布及亚细胞定位、生理功能及其基因的研究进展 ;同时还简要介绍了谷氨酸脱氢酶。

氮代谢相关酶的研究进展

氮代谢是植物体内的基本生理代谢过程之一,包括氮素同化、积累和蛋白质合成等过程,与植物的生长发育、产量和品质的联系非常密切。氮代谢的生理过程在酶的催化下完成,与氮代谢的生理过程密切相关的酶有:硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、转氨酶(谷氨酸草酰乙酸转氨酶、谷氨酸丙酮酸转氨酶)、谷氨酸合酶、谷氨酸脱氢酶等关键酶。这5种酶在植物氮代谢过程中具有重要的作用,简要介绍这几种酶的基本结构与特性、对作物生长发育的调控等,为进一步探究氮代谢研究机制提供有益的参考。