两阶段pH控制和碳氮源协同补加促进谷氨酸棒杆菌高产L-谷氨酰胺

为提高谷氨酸棒杆菌发酵产L-谷氨酰胺产量、糖酸转化率、生产强度等技术指标,该文通过响应面法优化了摇瓶发酵培养基中葡萄糖、(NH_(4))_(2)SO_(4)和玉米浆含量,并利用50 L发酵罐进行分批发酵,构建了菌体生长、底物消耗和产物生成动力学模型,进而在50 L发酵罐中采用两阶段控制pH策略,并通过补加葡萄糖和(NH_(4))_(2)SO_(4),协同控制发酵液中碳氮源浓度,促进菌体高效合成L-谷氨酰胺。结果表明,优化后发酵培养基中葡萄糖、(NH_(4))_(2)SO_(4)和玉米浆含量分别为167、61、31 g/L,摇瓶发酵L-谷氨酰胺产量达到38.13 g/L,较优化前提高了34.12%;50 L发酵罐分批发酵80 h后L-谷氨酰胺产量达42.06 g/L,糖酸转化率达到25.85%,生产强度为0.53 g/(L·h);在50 L发酵罐中基于两阶段pH控制的碳氮源协同补加策略,显著促进了谷氨酸棒杆菌高产L-谷氨酰胺,发酵周期缩短至52 h,L-谷氨酰胺产量达68.01 g/L,糖酸转化率达33.93%,生产强度为1.31 g/(L·h)。该研究对促进L-谷氨酰胺的工业化生产具有重要参考价值。

谷氨酸棒杆菌人工核糖体结合位点(RBS)文库的建立与应用

核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)是一种重要的生物控制元件,是实现基因表达精细调控的重要工具,在微生物代谢工程和合成生物学中具有广泛的应用。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种重要的工业微生物,被广泛应用于多种氨基酸和有机酸的工业化发酵生产。然而目前,关于谷氨酸棒杆菌RBS元件文库的报道仍然较少。该研究基于谷氨酸棒杆菌RBS序列基本特征,设计构建了一个随机RBS文库。利用流式细胞分选技术和96孔板筛选技术,建立了RBS文库高通量筛选方法。通过2步筛选,构建了一个调控范围广,覆盖范围均匀的人工RBS元件文库,调控范围达到29.04倍。利用α-淀粉酶表达系统对构建的人工RBS文库进行测试和表征,结果表明人工RBS文库具有较高的稳定性和通用性。随后该研究将人工RBS文库应用于L-高丝氨酸生物合成途径的调控优化。利用不同强度RBS元件对L-高丝氨酸合成途径关键酶LysCr和Homr进行精细表达调控,获得了具有高效L-高丝氨酸合成能力的最佳组合,L-高丝氨酸产量到达12.7 g/L,比野生型菌株高丝氨酸含量提高了3.6倍。综上所述,该研究构建了一个调控范围广、稳定性高的谷氨酸棒杆菌人工RBS文库,为谷氨酸棒杆菌代谢工程改造和基因精细表达调控提供了有效的控制元件。

多基因同步调控结合高通量筛选构建高产L-苯丙氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株

L-苯丙氨酸(L-Phe)是重要的食品及医药中间体,但由于其生物合成途径较长且调控机制复杂,仅依靠质粒或者周期漫长的基因组逐轮改造,难以实现各个模块之间的通量平衡,在一定程度上限制了其产量的进一步提升。本研究将L-Phe生物合成途径中的7个携带组成型启动子PF11及核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)为GGGGGGGG的关键基因ppsA、tktA、aroF^(fbr)、aroE、aroL、pheA^(fbr)和tyrB,整合到谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因组中;利用课题组前期研发的基于CRISPR/Cas系统和胞苷脱氨酶的无模板基因表达调控技术(base editor-targeted and template-free expression regulation,BETTER),对每个关键基因的RBS进行同步编辑,生成富含G/A的RBS突变文库;利用前期开发的荧光蛋白型L-Phe生物传感器结合液滴微流控系统(droplet microfluidics)对RBS突变文库进行高通量筛选。最终,从大约7万个RBS突变文库中筛选到4株L-Phe产量提升不同程度的突变菌株,其72 h摇瓶发酵产量分别为2.06、1.30、4.42和7.44 mmol/L,相比对照菌株C.g-2(0.6 mmol/L)分别提高了2.43、1.17、6.37、11.40倍。利用碱基编辑器同时调节多基因的表达水平并筛选组合文库,可以为L-Phe工程育种提供一种可行策略。

基于响应面法优化谷氨酸棒杆菌发酵条件

该研究以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)P169为研究对象,以谷氨酸产量为主要评价指标,采用单因素试验和响应面法对其发酵条件进行优化,并进行摇瓶和20 L罐分批补料发酵验证。结果表明,谷氨酸棒杆菌P169产谷氨酸的最佳发酵条件为酵母粉41.0 g/L、葡萄糖27.0 g/L、尿素12.0 g/L和pH 7.0。在此优化条件下,谷氨酸产量达25.1 g/L,比优化前(16.5 g/L)提高了52.1%。以此为基料进行20 L罐分批补料发酵,谷氨酸产量达155 g/L,比优化前(142 g/L)提高了9.2%。该研究为提高谷氨酸棒杆菌谷氨酸产量提供了一种技术解决方案。

系统代谢工程改造谷氨酸棒杆菌高产L-丙氨酸

L-丙氨酸是一种重要的天然氨基酸,广泛应用于医药、食品、饲料等领域。目前,L-丙氨酸主要通过大肠杆菌来生产,开发安全、工业稳定的谷氨酸棒杆菌生产菌株具有重要的意义。该研究筛选了外源丙氨酸脱氢酶,在不以其他氨基酸为氨基供体的条件下高效率合成L-丙氨酸。强化非磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS)葡萄糖摄取途径,极大地促进了细胞的生长和L-丙氨酸的合成。引入异源Entner-Dondoroff途径,通过4步反应即可实现糖酵解途径10步反应供应前体物丙酮酸,进一步提高了L-丙氨酸的产量。此外,为了避免抗生素的使用和保证菌株的遗传稳定性,将关键基因整合到基因组上。最终工程菌株在5 L发酵罐发酵48 h产生104 g/L L-丙氨酸。该研究为利用谷氨酸棒杆菌工业化生产L-丙氨酸奠定了基础,同时为其他丙酮酸族产品的代谢工程研究提供了参考。

谷氨酸棒杆菌中L-半胱氨酸外排蛋白的鉴定及应用

L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,被广泛应用于食品,医药,化妆品等行业。有效的外排蛋白不仅可以降低反馈抑制和细胞毒性,还能提高菌体的生产能力。在细胞工厂的构建中发挥重要作用。该研究基于转录组测序分析,在谷氨酸棒杆菌中发现一种新的L-半胱氨酸外排蛋白Cg1298-Cg1299。当添加7.5 mmol/L L-半胱氨酸时,cg1298-cg1299缺失菌株的生长比对照菌株降低了约24.2%,而回补菌株恢复了对半胱氨酸的抗性。利用Cys-Tyr二肽进一步检测Cg1298-Cg1299对半胱氨酸的外排能力,发现cg1298-cg1299双敲菌株的L-半胱氨酸外排能力下降了26.3%。最后,在L-半胱氨酸底盘菌中过表达cg1298-cg1299使得L-半胱氨酸产量提高17.1%。综上所述,Cg1298-Cg1299是谷氨酸棒杆菌中一种新的L-半胱氨酸外排蛋白,其显著增强了谷氨酸棒杆菌对L-半胱氨酸的耐受性,并提高了L-半胱氨酸的生产能力,为将来构建高产L-半胱氨酸的细胞工厂提供了一个有效靶点。

利用代谢工程改造谷氨酸棒杆菌产丙酮酸研究

丙酮酸是一种重要的有机酸,可以作为前体物质,参与合成多种有机化合物,在生物体的能量代谢中发挥着重要作用。为提高丙酮酸产量,选择利用代谢工程改造谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)生产丙酮酸。利用同源重组的方法,依次敲除谷氨酸棒杆菌中与丙酮酸代谢支流相关的5个关键基因(丙酮酸醌氧化还原酶基因pqo、丙酮酸羧化酶基因pyc、转氨酶基因alaT、缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶基因avtA、丙酮酸脱氢酶基因aceE),摇瓶发酵72 h后丙酮酸的产量达到14.64 g/L。通过过表达编码转酮醇酶基因tkt、转醛酶基因tal、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pck,增加合成丙酮酸前体物质的供应。最终,复合培养基摇瓶发酵72 h后,发酵液中丙酮酸的产量达到15.39 g/L,与野生型菌株相比提高了28倍。研究旨在为利用微生物发酵生产丙酮酸提供一定的理论参考。

谷氨酸棒杆菌脂肪酸合成酶fasA基因的异源表达对脂肪酸合成的影响

旨在为脂肪酸高产菌株的筛选和构建奠定理论基础,研究谷氨酸棒杆菌脂肪酸合成酶A(FasA)对大肠杆菌脂肪酸合成的影响,利用生物信息学软件预测分析了FasA的性质并构建过表达载体pXMJ19-fasA,转化至大肠杆菌进行表达,对表达诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度进行考察,并测定了异源表达后的脂肪酸组成。结果表明,重组菌株在IPTG浓度为1 mmol/L下诱导20 h,棕榈油酸和油酸产量分别达到1.735、2.325 mg/g,与对照菌株相比分别提高了53.95%和59.68%。研究结果说明FasA对大肠杆菌合成棕榈油酸和油酸有促进作用。

基于非靶向代谢组学分析谷氨酸棒杆菌分泌表达外源蛋白代谢差异

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)由于其无内毒素以及有完善的分泌系统可用于分泌生产重组医药蛋白,被认为是很有潜力的外源蛋白表达宿主。外源蛋白分泌表达涉及蛋白合成、运输以及分泌等多个耗能过程,能量代谢的扰动引起宿主细胞整体代谢水平的变化。该研究以C.glutamicum CGMCC1.15647菌株为研究对象,利用非靶向代谢组学比较分泌表达外源蛋白对菌株自身代谢的影响,发现在分泌表达外源蛋白组中共有176个差异代谢物,其中79个代谢物显著上调表达,97个代谢物显著下调表达,关键代谢物为D-甘露糖-6-磷酸、叶酸、肌苷、L-色氨酸、L-苯丙氨酸等。差异代谢物通路分析表示,分泌表达外源蛋白会导致中心代谢加剧和多种氨基酸特别是芳香族氨基酸代谢的变化,以满足蛋白合成和分泌对能量的需求,同时保护胞内蛋白以维持菌体正常生长。该文从代谢水平上探究C.glutamicum CGMCC1.15647分泌外源蛋白过程中的关键代谢物及代谢调控网络,对于优化C.glutamicum细胞中代谢流使之趋向于有利于蛋白分泌表达有重要的研究意义。

基于代谢途径改造谷氨酸棒杆菌生产L-缬氨酸

L-缬氨酸是一种重要的支链氨基酸,随着市场对其需求量的不断提升,进一步提高L-缬氨酸的产量和糖酸转化率具有重要意义。在该研究中,使用实验室保藏的谷氨酸棒杆菌VHL-1作为出发菌株,通过对L-缬氨酸合成路径进行代谢改造显著提高了L-缬氨酸的产量和丙酮酸前体物的供应。首先,通过敲除ldh(编码乳酸脱氢酶)、poxB(编码丙酮酸氧化酶)、pyc(编码丙酮酸羧化酶)基因以及弱化alaT(编码丙氨酸转氨酶)基因表达来实现丙酮酸的富集。其次,通过强启动子P_(tuf)替换ilvBNC操纵子原始启动子并增加ilvBN(编码乙酰羟酸合酶)基因拷贝数来增强丙酮酸向L-缬氨酸合成的碳代谢流。最后,通过过表达支链氨基酸转运蛋白编码基因brnFE和调节蛋白编码基因lrp增强L-缬氨酸胞外输出效率。最终构建的重组菌株VHL-9在5 L生物反应器中进行补料分批培养,L-缬氨酸产量可到达(82.5±5.6)g/L,生产强度为1.15 g/(L·h),糖酸转化率为0.302 g/g葡萄糖。

生物制造氨基酸的谷氨酸棒杆菌细胞工厂转运工程研究进展

氨基酸作为生物制造产业中的重要功能性产品之一,已广泛应用于食品、医药、饲料、化工等领域。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是生物合成氨基酸最重要的微生物菌株。因此,构建高效的谷氨酸棒杆菌微生物细胞工厂对高产量、高效率和高转化率地生产氨基酸意义重大。高效生物制造氨基酸的微生物细胞工厂不仅需要具有强大的合成代谢能力,还需要高效的转运能力。文章从谷氨酸棒杆菌的底物转运和氨基酸的分泌转运以及氨基酸的再吸收等方面对近年来的研究进展进行综述,并展望了未来发展方向。

基因编辑技术在谷氨酸棒杆菌中的应用研究进展

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种绿色高效的底盘微生物,可用于生产大宗氨基酸、精细化学品、营养保健品等众多高附加值产品。基因编辑技术作为一种有效的调控菌株代谢网络的手段,在谷氨酸棒杆菌合成生物学研究、理性改造高产菌株等方面发挥着巨大潜力。然而,谷氨酸棒杆菌的遗传操作仍存在挑战。该文综述了谷氨酸棒杆菌常用基因编辑技术,详细阐述了传统基因编辑技术、规律成簇间隔短回文重复序列及其相关的蛋白(CRISPR/Cas)介导的基因编辑技术及CRISPR干扰(CRISPRi)技术的作用机制及其在谷氨酸棒杆菌中的应用研究进展。旨在为基因编辑技术在谷氨酸棒杆菌菌株设计和生产高附加值产品方面提供依据。

谷氨酸棒杆菌中胞嘧啶碱基编辑工具的PAM拓展

碱基编辑是一种新兴的基因组编辑技术,具有不产生双键断裂、不依赖同源重组且不需要添加外源模板的优势,在真核及原核生物中得到了广泛的开发与应用。为了进一步扩展碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中的基因组覆盖范围,本研究将3种PAM限制较为宽松的新型Cas9突变体应用于胞嘧啶碱基编辑工具中,分别为近乎PAMless的SpRY突变体(NRN>NYN PAM)、SpG突变体(NGN PAM),以及ScCas9^(++)蛋白(NNG PAM),实现对碱基编辑工具的PAM拓展。结合SpRY突变体的碱基编辑系统展示出了更宽松的PAM识别,除对CAT、CAC、TAA PAM的位点完全没有编辑外,对其他NRN种类的PAM位点均出现了不同程度的识别,但整体编辑效率低,难以推广应用;结合SpG突变体的碱基编辑系统可实现对所有NGN种类PAM位点的编辑,且编辑效率优于SpRY突变体,但对NGG PAM位点的编辑,相比原始Cas9蛋白,编辑效率下降9.3%-55.9%;结合ScCas9^(++)蛋白的碱基编辑系统,除对TCG、CTG PAM的基因组位点没有编辑外,可实现对其他测试NNG PAM的基因组位点编辑,大部分位点基因组编辑效率均较高,最高可达100%。本研究的开展不仅有助于碱基编辑工具在谷氨酸棒杆菌中覆盖更多的基因组位点,同时也为其他基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑工具的PAM拓展提供有力的参考。

谷氨酸棒杆菌核苷水解酶的酶学性质研究

核苷水解酶是一类催化核苷生成D-核糖及嘌呤或嘧啶的酶,广泛存在于除哺乳动物以外的生物中。该研究表达并纯化了3个来源于谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的核苷水解酶Cgl1364、Cgl1977和Cgl2835并考察其酶学特性。酶学实验结果表明,重组Cgl1364、Cgl1977和Cgl2835均具有核苷水解酶活性;能够催化腺苷、胞苷、鸟苷、黄苷、肌苷和尿苷生成D-核糖和相应的嘌呤或嘧啶,但底物特异性有所差异;重组酶在15~55℃以及pH 4~10条件下均具有活性,其最适温度和pH分别为35℃和7.0;Cgl1977的热稳定性优于Cgl1364和Cgl2835。利用BL-cgl1364静息细胞为酶源催化水解尿苷,底物转化率达到89.5%。该研究首次报道了谷氨酸棒杆菌核苷水解酶的功能和性质,可为D-核糖、嘌呤及嘧啶的“一锅法”生物合成提供重要参考。

基于提高L-异亮氨酸生产效率谷氨酸棒杆菌构建和混菌发酵

L-异亮氨酸是多数哺乳动物必需氨基酸,广泛应用在食品、医药、运动营养等领域。为促进细胞内L-异亮氨酸外排,提高发酵液中L-异亮氨酸含量,以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)IBCL-1为出发菌株,构建CI01、CI02、CI03与IBCL-1ΔlysA 4株菌株。通过发酵对比CI01、CI02、CI03菌株生产L-异亮氨酸能力,其中CI01菌株L-异亮氨酸产量最高为21.36 g·L^(-1),相较于出发菌株IBCL-1提高6.8%。为降低主要副产物L-赖氨酸含量,敲除合成IBCL-1中L-赖氨酸关键基因lysA,所获菌株IBCL-1ΔlysA可大量消耗外源L-赖氨酸。最后将CI01与IBCL-1ΔlysA菌株混合发酵生产L-异亮氨酸,确定13:1为两种菌接种量最佳配比,发酵液中L-异亮氨酸含量为22.96 g·L^(-1),L-赖氨酸含量为0.42 g·L^(-1),显著提高L-异亮氨酸生产效率。

谷氨酸棒杆菌发酵过程的酸/碱胁迫及其响应的分子机制

放线菌属细菌谷氨酸棒杆菌被广泛用于发酵工业,生产各种氨基酸和多种生物基化学品的主要工业菌株之一。在发酵过程中谷氨酸棒杆菌会受到多种环境条件的胁迫,pH胁迫是其中之一。谷氨酸棒杆菌是中性偏碱型细菌,生长pH范围在6.0~9.0之间,一旦环境pH值低于5.0或高于9.5,谷氨酸棒杆菌胞内的pH稳态将被完全破坏掉,严重抑制菌体生长甚至使菌体死亡。因此,在工业发酵中,谷氨酸棒杆菌的对酸/碱的耐受性能研究显得尤为重要。文章综述了谷氨酸棒杆菌在发酵工业生产中受到的各类酸/碱胁迫以及进化出耐受酸/碱胁迫的不同分子机制,对目前已有的机制进行了总结并做出了展望。

谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌生物合成L-甲硫氨酸的代谢工程改造研究进展

L-甲硫氨酸是生命体必需的唯一含硫氨基酸,其作为前体参与合成多种生物活性物质,并参与机体多种代谢,被广泛应用于食品、动物饲料、药品、化妆品等领域。由于L-甲硫氨酸是唯一无法用微生物发酵法工业化生产的必需氨基酸,近年来,利用代谢工程提升L-甲硫氨酸产量受到国内外研究人员的普遍重视。本文主要分析并比较在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中L-甲硫氨酸的生物合成途径及代谢调控网络机制;分别从解除代谢途径对关键酶的反馈作用、阻断或削弱支路代谢途径、中心代谢调控网络的优化、增强辅助因子的供应以及转运系统的优化这5个方面综述L-甲硫氨酸代谢工程改造策略,总结L-甲硫氨酸的生物合成研究进展并作展望,旨在为L-甲硫氨酸高产发酵菌株的选择提供依据。

氨基脱氧分支酸合成酶对谷氨酸棒杆菌生长和产L-丝氨酸的影响

L-丝氨酸是化学和材料领域中最为重要的30个骨架化合物之一,但至今尚未实现微生物发酵法工业化生产L-丝氨酸。氨基脱氧分支酸合成酶(aminodeoxychorismate synthase,ADC synthase)是L-丝氨酸分解代谢相关的关键酶,研究前期发现,与出发菌株SSAAI相比,通过ARTP诱变获得的高产L-丝氨酸突变株A36中氨基脱氧分支酸合成酶编码基因pabAB 426位发生点突变(T426I),而氨基脱氧分支酸合成酶基因突变对酶活力、菌株生长及产L-丝氨酸的影响尚未见报道。该文采用pK18 mobsacB质粒在出发菌株SSAAI上对pabAB进行426位定点突变(T426I)研究,结果发现,pabAB定点突变株的生物量比出发菌株SSAAI下降29.3%,L-丝氨酸产量提高15.9%。同时对氨基脱氧分支酸合成酶酶活力进行测定,发现氨基脱氧分支酸合成酶编码基因pabAB 426位的T426I突变导致酶的比活力下降。进一步采用不同强度的启动子调控高产菌株A36中氨基脱氧分支酸合成酶的活力,构建重组菌株A36-Pkan和A36-Dap-e;与出发菌株A36相比,重组菌氨基脱氧分支酸合成酶的比酶活力均有提高,发酵120 h时,生物量分别提高8.3%和16%,而L-丝氨酸产量分别下降18.2%和22.6%,说明提高氨基脱氧分支酸合成酶酶活力有利于谷氨酸棒杆菌生长却不利于产L-丝氨酸。

谷氨酸棒杆菌细胞工厂育种策略以及高通量筛选技术的研究进展

谷氨酸棒杆菌作为工业生产氨基酸及众多高附加值产品的工程菌株,是一种绿色高效的底盘微生物,已被开发为工业微生物细胞工厂。设计与构建高效工业微生物细胞工厂是绿色生物制造的重要基础,也是促进实现“碳中和”目标的重要途径之一。微生物育种及高通量筛选技术是创制高效微生物细胞工厂和生物产业技术创新的重要方向。文章结合实际案例针对谷氨酸棒杆菌细胞工厂的育种策略和高通量筛选技术进行综述,以期为谷氨酸棒杆菌选育领域的相关研究提供参考和借鉴。

基于低拷贝质粒的高产紫色杆菌素谷氨酸棒杆菌的构建和发酵

该研究以公认安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为宿主,构建高产紫色杆菌素的重组菌株。利用谷氨酸棒杆菌天然大质粒pTET3的复制与分配元件,构建了低拷贝质粒pOK12CG1,该质粒在谷氨酸棒杆菌中的拷贝数约为6拷贝/基因组,且与谷氨酸棒杆菌常用质粒pEC-XK99E和pXMJ19兼容。以低拷贝质粒pOK12CG1为骨架构建了携带紫色杆菌素合成操纵子(vioABCDE)的质粒pCGvio,并分别以谷氨酸棒杆菌标准株ATCC 13032和插入序列(Insertion Sequence,IS)元件删除株为宿主,构建了7株合成紫色杆菌素的重组菌株。通过初步筛选,发现基于低拷贝质粒的重组菌株ATCC 13032/pCGvio,其紫色杆菌素产量(508.24 mg/L)高于基于中高拷贝质粒的重组菌株ATCC 13032/pECvio(376.16 mg/L),而基于低拷贝质粒的IS元件删除重组菌株ISDM023/pCGvio紫色杆菌素产量达到了610.13 mg/L。进一步采用正交实验设计对重组菌株ISDM023/pCGvio进行培养基体积比(V_(LB):V_(BHIS))、诱导时间和IPTG诱导剂浓度这3个因素的发酵条件优化。结果表明,在VLB:VBHIS为1:2、诱导时间为18 h、IPTG浓度为0.75 mmol/L的优化条件下,紫色杆菌素的摇瓶发酵产量可达了1007.47 mg/L。该研究成功构建了紫色杆菌素的谷氨酸棒状杆菌重组菌株ISDM023/pCGvio,为谷氨酸棒状杆菌高效合成紫色杆菌素奠定了实验基础,也为其它产物的高效合成提供参考。