表达元件优化促进重组胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中的表达

重组胶原蛋白是一种具有广泛应用潜力的生物材料,近年来引起了生物医学、组织工程等众多领域的关注。胶原蛋白的3股螺旋结构赋予其独特的生物学功能和生物相容性,但也增加了其在微生物系统中表达的复杂性。该研究以细菌胶原蛋白V-B作为模式蛋白,通过对表达元件的优化,促进重组胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中的表达。首先通过启动子筛选和发酵时长优化,获得介导V-B表达的最优启动子tac-R0。接着利用RBS calculator设计核糖体结合位点(ribosomal binding site,RBS)和间隔序列(aligned spacing,AS)的突变文库,得到与tac-R0启动子搭配组合的最优RBS和AS,使V-B的产量提高至514 mg/L。此外,通过多基因表达盒的串联组合策略,将多个目的基因串联,最终V-B的产量较初始水平提高了8.4倍,达697 mg/L,该研究为重组胶原蛋白的工业化生产提供了基础。

谷氨酸棒状杆菌合成L-高丝氨酸的代谢改造与发酵条件探究

目的:本研究以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032为底盘细胞,构建1株L-高丝氨酸合成菌株并分析溶氧环境对其产物合成的影响。方法:首先通过外源添加0~40 g/L的L-高丝氨酸分析谷氨酸棒状杆菌的产物耐受性;随后,通过基因thrB敲除阻断L-高丝氨酸的降解途径,获得谷氨酸棒状杆菌重组菌H1;在此基础上利用挡板摇瓶进行细胞培养以增强发酵过程中氧气供给能力。结果:与大肠杆菌相比,谷氨酸棒状杆菌对L-高丝氨酸具有更强耐受性。研究中通过敲除基因thrB构建了L-苏氨酸缺陷型谷氨酸棒状杆菌重组菌H1,发现基础培养基中加入0.5 g/L的L-苏氨酸后,该重组菌生长恢复正常水平。挡板摇瓶条件下重组菌H1的L-高丝氨酸产量增加至836.7 mg/L,较普通摇瓶产量44.6 mg/L提高了17.76倍。结论:通过阻断L-苏氨酸的合成,成功构建L-高丝氨酸合成菌株谷氨酸棒状杆菌H1,并且发现利用挡板摇瓶增强发酵过程中供氧能力是促进谷氨酸棒状杆菌高效合成L-高丝氨酸的有效手段,为后续提高L-高丝氨酸发酵产量提供了参考。

基于T7转录系统的谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的创建

本研究以前期构建的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pAU2为基础,通过添加T7 RNA聚合酶编码基因及人工合成的克隆表达区,构建了1个新的谷氨酸棒杆菌分泌型基因高效表达载体pAU29KS。pAU29KS载体克隆/表达盒使用T7启动子作为目的基因的启动子,通过载体序列中T7 gene 1基因编码的T7 RNA聚合酶与T7启动子互作来进行目的基因的高效转录;启动子区下游使用谷氨酸棒杆菌核糖体结合位点RBS保守序列(gaaagga)来高效起始目的蛋白合成;克隆/表达盒RBS与多克隆位点MCS之间使用谷氨酸棒杆菌强信号肽cgl_2070编码序列来进行目的蛋白的胞外高效分泌。以嗜热脂肪土芽孢杆菌的α-淀粉酶AmyF作为报告蛋白,进行谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pAU29KS表达系统的蛋白分泌生产能力检测。透明圈法检测结果显示,工程菌株C.glutamicum/pAU29KS-amyF能够在淀粉平板上产生清晰可见的透明圈;培养物上清液的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和Western Blotting检测结果都显示出清晰的特异性条带,与AmyF预测分子量相一致;淀粉酶活性检测结果显示,培养物上清液呈现高淀粉酶活力,而细胞裂解上清液未检测到淀粉酶活力,说明高效表达的α-淀粉酶在强信号肽cgl_2070的介导下完全分泌到胞外培养基中。本研究构建的基于T7转录系统的C.glutamicum/pAU29KS能够对目标蛋白进行高效分泌生产,是一套新的谷氨酸棒杆菌分泌型重组蛋白表达系统。

香柠檬精油抗伪结核棒状杆菌作用及机制研究

伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis,Cp)感染可影响家畜尤其是反刍动物羊的生产性能,本文旨在筛选对Cp有抑杀活性的植物精油并研究其作用机制,为Cp感染防控提供参考。通过纸片扩散法从4种植物精油中筛选出能高效抑杀Cp的香柠檬精油(bergamot essential oil, BEO),采用刃天青指示剂微量肉汤稀释法测定BEO对Cp不同菌株的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)。通过体外试验评价BEO对Cp感染J774A.1巨噬细胞的影响。通过测定脏器载菌量、脾抗菌肽基因表达量和存活率综合评价BEO对Cp感染昆明系小鼠的保护作用。采用扫描电镜观察BEO作用后Cp菌体形态变化,并检测BEO作用后Cp的DNA泄漏以及毒力基因表达情况,初步研究BEO抗Cp机制。结果显示:BEO具有较强的抗Cp作用,其MIC为0.78~1.56μL·mL^(-1)。BEO可降低Cp感染小鼠肾、肝和腹水的细菌负荷(P<0.01),上调Cp感染小鼠脾中抗菌肽Cramp、Bpifal 1、mBD2、mBD3和mBD4的mRNA表达水平(P<0.01)。BEO处理可降低Cp对J774A.1巨噬细胞的感染率,提高被Cp感染小鼠的存活率(P<0.05)。BEO处理使Cp细胞膜凹陷,菌体内DNA外渗增加(P<0.05),以及下调毒力基因磷脂酶D(phospholipase D,pld)的表达(P<0.01)。BEO能抑杀Cp,改善Cp对小鼠的感染程度,其机制可能与BEO损伤Cp细胞膜造成DNA泄漏并降低毒力基因pld的mRNA表达,以及促进Cp感染小鼠抗菌肽Cramp、Bpifal 1、mBD2、mBD3和mBD4的表达有关。

谷氨酸棒状杆菌高丝氨酸脱氢酶单突变体酶学性质表征

通过定点突变技术,提高高丝氨酸脱氢酶(homoserine dehydrogenase,HSD)的催化活性,减少通路中代谢产物对其产生的反馈抑制和阻遏作用。对HSD与底物高丝氨酸分子进行对接,通过其空间结构分析,选择Asp61和Gly25两个关键位点进行定点饱和突变,通过酶活力筛选,发现突变体A61L和G25G较野生型(wildtype,WT)酶活力显著提高。对这两个突变体进行酶动力学和酶学性质研究,结果显示:相较于WT,A61L和G25G的Km值降低,底物亲和力增强,酶活力分别提高到1.21、1.35倍;n值减小,正协同性增加;A61L和G25G最适温度与WT相同均为40℃;A61L最适pH值与WT相同为8.0,G25G最适pH值为8.5较WT提高;A61L和G25G酶活力半衰期较WT分别延长1h和减少0.5h;低浓度K^(+)、Mg^(2+)、Ca^(2+)对突变体和WT有激活作用;不同体积分数甲醇、乙醇、乙腈和二甲基亚砜对突变体和WT有明显抑制作用;在1~25mmol/L抑制剂浓度下,突变体受抑制作用较WT明显减弱。本研究获得酶活力提高、别构抑制减弱的突变体G25G和A61L,为优化HSD合成代谢途径和构建高产蛋氨酸、苏氨酸和异亮氨酸菌株提供了参考。

基于低拷贝质粒的高产紫色杆菌素谷氨酸棒杆菌的构建和发酵

该研究以公认安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为宿主,构建高产紫色杆菌素的重组菌株。利用谷氨酸棒杆菌天然大质粒pTET3的复制与分配元件,构建了低拷贝质粒pOK12CG1,该质粒在谷氨酸棒杆菌中的拷贝数约为6拷贝/基因组,且与谷氨酸棒杆菌常用质粒pEC-XK99E和pXMJ19兼容。以低拷贝质粒pOK12CG1为骨架构建了携带紫色杆菌素合成操纵子(vioABCDE)的质粒pCGvio,并分别以谷氨酸棒杆菌标准株ATCC 13032和插入序列(Insertion Sequence,IS)元件删除株为宿主,构建了7株合成紫色杆菌素的重组菌株。通过初步筛选,发现基于低拷贝质粒的重组菌株ATCC 13032/pCGvio,其紫色杆菌素产量(508.24 mg/L)高于基于中高拷贝质粒的重组菌株ATCC 13032/pECvio(376.16 mg/L),而基于低拷贝质粒的IS元件删除重组菌株ISDM023/pCGvio紫色杆菌素产量达到了610.13 mg/L。进一步采用正交实验设计对重组菌株ISDM023/pCGvio进行培养基体积比(V_(LB):V_(BHIS))、诱导时间和IPTG诱导剂浓度这3个因素的发酵条件优化。结果表明,在VLB:VBHIS为1:2、诱导时间为18 h、IPTG浓度为0.75 mmol/L的优化条件下,紫色杆菌素的摇瓶发酵产量可达了1007.47 mg/L。该研究成功构建了紫色杆菌素的谷氨酸棒状杆菌重组菌株ISDM023/pCGvio,为谷氨酸棒状杆菌高效合成紫色杆菌素奠定了实验基础,也为其它产物的高效合成提供参考。

利用代谢工程改造谷氨酸棒杆菌产丙酮酸研究

丙酮酸是一种重要的有机酸,可以作为前体物质,参与合成多种有机化合物,在生物体的能量代谢中发挥着重要作用。为提高丙酮酸产量,选择利用代谢工程改造谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)生产丙酮酸。利用同源重组的方法,依次敲除谷氨酸棒杆菌中与丙酮酸代谢支流相关的5个关键基因(丙酮酸醌氧化还原酶基因pqo、丙酮酸羧化酶基因pyc、转氨酶基因alaT、缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶基因avtA、丙酮酸脱氢酶基因aceE),摇瓶发酵72 h后丙酮酸的产量达到14.64 g/L。通过过表达编码转酮醇酶基因tkt、转醛酶基因tal、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pck,增加合成丙酮酸前体物质的供应。最终,复合培养基摇瓶发酵72 h后,发酵液中丙酮酸的产量达到15.39 g/L,与野生型菌株相比提高了28倍。研究旨在为利用微生物发酵生产丙酮酸提供一定的理论参考。

基因编辑技术在谷氨酸棒杆菌中的应用研究进展

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种绿色高效的底盘微生物,可用于生产大宗氨基酸、精细化学品、营养保健品等众多高附加值产品。基因编辑技术作为一种有效的调控菌株代谢网络的手段,在谷氨酸棒杆菌合成生物学研究、理性改造高产菌株等方面发挥着巨大潜力。然而,谷氨酸棒杆菌的遗传操作仍存在挑战。该文综述了谷氨酸棒杆菌常用基因编辑技术,详细阐述了传统基因编辑技术、规律成簇间隔短回文重复序列及其相关的蛋白(CRISPR/Cas)介导的基因编辑技术及CRISPR干扰(CRISPRi)技术的作用机制及其在谷氨酸棒杆菌中的应用研究进展。旨在为基因编辑技术在谷氨酸棒杆菌菌株设计和生产高附加值产品方面提供依据。

双底物指数流加和双阶段溶氧控制对谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸的影响

为了实现L-异亮氨酸的高效生产,提高谷氨酸棒状杆菌YILW生产L-异亮氨酸的产量和生产强度,在详尽分析磷酸盐和玉米浆初始浓度对L-异亮氨酸发酵影响的基础上采用了双底物(玉米浆、磷酸盐)指数流加与双阶段溶氧相结合的控制策略进行L-异亮氨酸发酵。结果表明,最佳磷酸盐和玉米浆浓度分别为1.5 g/L和35 mL/L,此条件下分批补料发酵菌体生物量和L-异亮氨酸产量分别为27.66 g/L和25.89 g/L。在生长阶段进行双底物指数流加并结合双阶段溶氧控制,发酵60 h菌体生物量和L-异亮氨酸产量分别为32.29 g/L和31.32g/L,较优化前分别提高16.73%和20.97%。

基于提高L-异亮氨酸生产效率谷氨酸棒杆菌构建和混菌发酵

L-异亮氨酸是多数哺乳动物必需氨基酸,广泛应用在食品、医药、运动营养等领域。为促进细胞内L-异亮氨酸外排,提高发酵液中L-异亮氨酸含量,以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)IBCL-1为出发菌株,构建CI01、CI02、CI03与IBCL-1ΔlysA 4株菌株。通过发酵对比CI01、CI02、CI03菌株生产L-异亮氨酸能力,其中CI01菌株L-异亮氨酸产量最高为21.36 g·L^(-1),相较于出发菌株IBCL-1提高6.8%。为降低主要副产物L-赖氨酸含量,敲除合成IBCL-1中L-赖氨酸关键基因lysA,所获菌株IBCL-1ΔlysA可大量消耗外源L-赖氨酸。最后将CI01与IBCL-1ΔlysA菌株混合发酵生产L-异亮氨酸,确定13:1为两种菌接种量最佳配比,发酵液中L-异亮氨酸含量为22.96 g·L^(-1),L-赖氨酸含量为0.42 g·L^(-1),显著提高L-异亮氨酸生产效率。

全局调控因子Lrp的表达强化谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸

作者研究发现全局调控因子Lrp的表达能促进谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸,但对菌体生长有一定影响。RT-PCR分析发现:Lrp的表达能提高L-缬氨酸合成相关基因ilv A、ilv BN、ilv C、ilv D及转运相关基因brn FE的转录水平,这也许是L-缬氨酸产量提高的原因。实验还发现:表达含有点突变(Arg39Trp)的Lrp可以进一步提高谷氨酸棒状杆菌L-缬氨酸的产量,而且对菌体生长的影响也减小;这种效果在lrp-brn F间隔区域存在突变的L-缬氨酸生产菌VWB-1中更加明显。在VWB-1中共表达lrp1和brn FE基因,5 L罐发酵L-缬氨酸产量达到42.1 g/L,比对照提高了48.9%。

代谢工程方法改造谷氨酸棒状杆菌生产乙偶姻

应用代谢工程方法对Corynebacterium glutamicum ATCC 13032生物合成乙偶姻进行了研究.在C.glutamicum ATCC 13032中导入了Bacillus subtilis 168的乙偶姻合成途径的相关基因als SD操纵子,工程菌株的乙偶姻产量为2.14,g/L.为了增加合成乙偶姻的直接前体物丙酮酸的供给,进一步敲除了丙酮酸脱氢酶复合体E1亚基的编码基因(ace E)和乳酸脱氢酶基因(ldh A),工程菌株的乙偶姻产量提高到5.09,g/L.最后,敲除了工程菌株的2,3-丁二醇脱氢酶基因(but A)以阻断副产物2,3-丁二醇的合成,在优化的溶氧条件下,菌株CGL3在基本培养基中乙偶姻产量提高到8.33,g/L,达到理论得率的51.5%.实验结果表明经过代谢工程改造的C.glutamicum ATCC 13032具有良好的乙偶姻合成能力和应用潜力.

谷氨酸棒状杆菌成分分析及其酸水解条件研究

对废弃的谷氨酸棒状杆菌成分进行分析,评估其作为培养基用有机氮添加物质的可能性。测定结果表明:谷氨酸棒状杆菌中粗蛋白含量74%,核酸含量6.53%,粗脂肪含量11.36%,灰分含量2.78%,营养成分比较丰富,具有较高的开发利用价值。通过正交实验得到酸水解谷氨酸棒状杆菌的最佳条件为:pH 0.5、水解温度115℃、菌体浓度15 g/100 mL、水解时间20 h。在上述条件下菌体蛋白水解度(DH)达到88.37%。

谷氨酸棒状杆菌厌氧产丁二酸的发酵条件

考察谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh厌氧产丁二酸的发酵条件。结果发现:补加NaHCO3的效果最好,并且考察了NaHCO3浓度对葡萄糖转化速率及丁二酸生成速率的影响。运用代谢流分析方法分析了乳酸脱氢酶基因敲除对谷氨酸棒状杆菌厌氧代谢的影响,发现乳酸脱氢酶基因敲除导致磷酸烯醇式丙酮酸生成丁二酸的流量提高了214.3%,流向乳酸的流量变为0;分批厌氧转化36 h生成41.2 g/L丁二酸,产率45.0%。

贯叶连翘总提取物对谷氨酸棒状杆菌和粪产碱杆菌的抗菌作用

报道了经光照和未经光照处理后贯叶连翘总提取物对谷氨酸棒状杆菌和粪产碱杆菌的作用 ,结果表明 ,总提取物对谷氨酸棒状杆菌有强烈的抑菌和杀菌作用 ,对粪产碱杆菌有抑菌作用 ;其抑菌或杀菌作用与其浓度有关 。

不同表达模式组合对谷氨酸棒状杆菌中脑钠肽蛋白表达的影响

外源蛋白表达系统按照启动子作用方式可分为诱导型和组成型,按照蛋白表达后的定位可分为胞内表达和分泌表达。为了研究外源蛋白在谷氨酸棒状杆菌中最适的表达模式组合,以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)为模式蛋白构建用于研究谷氨酸棒状杆菌不同表达模式的快速表达体系,并利用这一体系研究脑钠肽(B-type natriuretic peptide,BNP)的最适表达模式。结果表明,相比于诱导型胞内表达、诱导型分泌表达、组成型分泌表达模式,BNP通过组成型胞内表达可达到最高的表达量。表达产物经过NI-NTA亲和层析,可得到纯化的BNP产量为235.5 mg/L,纯度可达90%。该研究构建了一套谷氨酸棒状杆菌中外源蛋白不同表达模式组合的快速检测方法,并成功实现了BNP的表达,这对以谷氨酸棒状杆菌作为宿主表达外源蛋白具有重要的指导意义。

谷氨酸棒状杆菌CRISPR-Cpf1/ssDNA基因组编辑系统优化

谷氨酸棒状杆菌作为重要的微生物细胞工厂,基因组修饰已经成为调节目标代谢物的首要途径。为了提高基因定点突变的编辑效率,建立了高效省时的CRISPR-Cpf1/ssDNA基因组编辑系统。利用卡那霉素抗性作为筛选标记,构建了1株严谨的单链模式菌M-1,用于验证与统计编辑效率。首先,采用强启动子Ptuf,优化了切割效率;其次,利用重组酶RecT和合理长度与添加量的ssDNA,优化了重组效率。实验结果显示:在启动子Ptuf和RecT的双重作用下,采用滞后链(70bp、12.5μg)优化组合方式,使基因编辑效率提升至(80±5.7)%。由RecT介导的CRISPR-Cpf1/ssDNA基因组编辑系统可在很大程度上加快谷氨酸棒状杆菌代谢工程改造。

外源蛋白表达过程中谷氨酸棒状杆菌转录组及代谢物的多变元分析

以谷氨酸棒状杆菌为研究对象,在发酵罐水平30%溶解氧条件下对野生菌及表达EGFP的工程菌进行平行培养,对培养20 h的菌体进行转录组分析,并对不同时间点所取样品进行代谢物检测。利用多变元分析方法分析转录组和代谢物数据,其中主要利用主成分分析法进行关键因素分析,利用正交偏最小二乘法判别分析进行转录组数据分析,继而通过S-plot得到不同溶解氧下的生物标记物(biomarkers),最终找到了8个关键基因。代谢数据分析结果表明ATP、谷氨酸、乙酸、胞内谷氨酸、甲硫氨酸及乳酸是外源蛋白表达的关键代谢物;通过不同时间点代谢物含量变化分析发现外源蛋白表达的代谢变化类似于低氧环境下的代谢变化现象,即糖酵解增强,TCA溢流,回补途径增加,乙酸、乳酸生成增加。通过对比外源蛋白表达工程菌与野生菌的转录组数据及代谢物含量数据,为今后在代谢工程中菌株改造、优化代谢获得高效表达外源蛋白的谷氨酸棒状杆菌表达宿主奠定基础。

高产L-精氨酸谷氨酸棒状杆菌的构建

以产L-精氨酸诱变菌株谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)AJC为出发菌株,采用基因组编辑技术对其进行改造。首先,敲除阻遏蛋白ArgR和FarR,解除反馈阻遏作用;然后,敲除乳酸脱氢酶编码基因ldh和整合鸟氨酸乙酰转移酶编码基因argJ,阻断乳酸合成途径和增加前体物;最后,敲除谷氨酸分泌蛋白编码基因NCgl1221和整合乙酰谷氨酸激酶基因argB,减弱L-谷氨酸的胞外分泌,筛选一株L-精氨酸高产菌株。结果表明,获得一株高产L-精氨酸菌株AJC-4(C. glutamicum AJCΔargRΔfarRΔldh::PtufargJ ΔNCgl1221::PsodargB),该菌株在5 L发酵罐中发酵64 h后,L-精氨酸产量和糖酸转化率分别为78.0 g/L和0.38 g/g,较出发菌株AJC分别提高21.9%、18.8%;副产物乳酸和L-谷氨酸积累量分别为0.11 g/L、0.16 g/L,较出发菌株AJC分别降低96.8%、96.1%。

谷氨酸棒状杆菌乙酸盐代谢PTA、AK、ICL和MS酶活性研究

从谷氨酸棒状杆菌乙酸盐代谢中涉及的磷酸转乙酰酶PTA、乙酸盐激酶AK、异柠檬酸裂解酶ICL和苹果酸合成酶MS 4种酶入手,建立了一套稳定的酶活性测定方法,并对这些酶在葡萄糖和乙酸盐不同碳源代谢中的酶活性特征进行了比较分析,发现碳代谢中存在葡萄糖效应;乙酸盐对谷氨酸棒状杆菌PTA、AK、ICL和MS酶活性有明显的诱导作用.