大鼠脑谷氨酸脱羧酶基因的cDNA克隆及序列分析

胰岛β－细胞自身抗原蛋白之一是脑中谷氨酸脱羧酶（Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＧＡＤ，ＥＣ４．１．１．１５）同源物。以双链ｃＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ方法快速克隆了Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑ＧＡＤ基因的ｃＤＮＡ，将此包括编码５９３个氨基酸的全长ＤＮＡ片段重组入ｐＵＣ质粒并用双脱氧末端终止法测定了全部序列，证明其全长为１７７９ｂｐ．经比较发现Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑与Ｒｕｓｓｅｌｌ报导的大鼠脑ＧＡＤ基因序列，有一处碱基的差别，但并不涉及氨基酸的改变。同时还对用ＰＣＲ扩增长片段ＤＮＡ进行了方法学上的探讨。

稻米胚芽谷氨酸脱羧酶的光谱分析

从稻米胚芽中分离纯化得到谷氨酸脱羧酶(GAD),经十二烷基磺酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、体积排阻高效液相色谱测得米胚GAD为双亚基组成,其相对分子质量为78000,亚基分子质量为40000;紫外-可见光谱特征为420nm处的弱吸收峰,这是辅基PLP与米胚GAD主链结合后产生的;荧光光谱主要表现为Tyr残基的荧光特征,脱辅基前后的荧光光谱完全相似;圆二色谱分析表明,在二级结构中,α-螺旋占13.2%,β-折叠占38.3%,是一种高β-折叠蛋白,脱辅基后蛋白质的二级结构的变化不大。

嗜热链球菌谷氨酸脱羧酶基因及其侧翼区序列分析

从嗜热链球菌Streptococcus thermophilus Y-2的谷氨酸脱羧酶基因(gadB)及其两侧旁邻序列出发,在GenBank中分别用Blastn、Blastx搜索同源序列。gadB在核酸水平上无法找到同源序列,在蛋白质水平上与多种细菌的谷氨酸脱羧酶同源。根据谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列构建系统发育树,菌株Y-2与具核梭杆菌Fusobacterium nucleatumsubsp.polymorphum ATCC10953的亲缘关系最近。gadB的上游侧翼区与嗜热链球菌LMG18311的插入序列IS1216转座酶基因具有很高的相似性。gadB的下游侧翼区在核酸水平上未找到同源序列,在蛋白质水平上与谷氨酸/γ-氨基丁酸转运蛋白有很高的相似性。菌株Y-2的gadB、gadC排列方式与大肠杆菌、弗氏志贺菌的相同,而与乳酸乳球菌、短小乳杆菌的相反。在已完成全基因组测序的3个模式株Streptococcus thermophilus LMG18311、CNRZ1066、LMD-9中均含有插入序列IS1216,但未发现谷氨酸脱羧酶基因gadB、谷氨酸/γ-氨基丁酸转运蛋白基因gadC。

水稻谷氨酸脱羧酶基因(OsGAD3)分子进化与表达分析

利用分子克隆技术从8个水稻品种中克隆到谷氨酸脱羧酶基因OsGAD3,并进行了相关的生物信息学及表达谱分析.结果表明,不同水稻品种OsGAD3的核苷酸序列差异性很小,都在1%以内,在氨基酸序列上都具有保守的结构域,在C末端均具有类似于OsGAD1结合CaM的关键氨基酸位点,但不同于OsGAD2.系统进化树分析表明,不同水稻品种的OsGAD3在进化上可以分为粳稻和籼稻两大类,与水稻常规分类相一致.此外,对不同水稻品种的谷氨酸脱羧酶基因的表达谱分析发现,OsGAD1、OsGAD2、OsGAD3、OsGAD4和OsGAD5在测试的11种水稻叶片中都有表达,但表达特征存在一定的差异性,可能与品种特性相关.

香蕉谷氨酸脱羧酶基因克隆与表达

根据抑制缩减杂交文库获得的香蕉谷氨酸脱羧酶基因片段,利用RACE技术,首次从香蕉果实中克隆了谷氨酸脱羧酶基因的cDNA全长.结果表明,该cDNA的ORF全长1 500 bp,编码499个氨基酸.Blast分析表明,该基因所推导的氨基酸序列与水稻、柑橘、白杨、番茄等具有较高的一致性,分别为82%、81%、79%、78%,推测其编码的蛋白质分子量为56.25 kD,等电点5.21,具有与钙调蛋白结合的C端延伸区域和磷酸吡哆醛结合位点.组织特异性和果实采后正常成熟不同阶段表达结果显示,该基因在香蕉根、茎、叶、花、果实中均有表达,果实中的表达量较高,正常成熟表达量的增加可能受内源乙烯诱导并促进乙烯生物合成,推测其可能在不同的生理过程中起作用,并且与果实成熟及乙烯生物合成密切相关.

产GABA发酵乳杆菌的筛选、发酵条件优化及其谷氨酸脱羧酶基因的克隆

从酸菜汁中分离到一株具有谷氨酸脱羧酶活力的乳酸菌YS2,经过16S rDNA序列分析鉴定为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。YS2在含1%L-谷氨酸钠的MRS培养基中,GABA的产量达到4.37 g/L。对YS2产GABA的碳源、氮源、初始pH进行了初步优化,确定最佳条件为:以蔗糖为主要碳源,以蛋白胨和牛肉膏为氮源,初始pH 6.0,在此条件下,GABA产量达到5.68 g/L。通过PCR顺利地扩增出了YS2菌株的谷氨酸脱羧酶gadB基因,将PCR产物与表达载体pEASY-E1连接。测序结果表明,YS2的谷氨酸脱羧酶与Lactobacillus fermentum F-6的谷氨酸脱羧酶序列一致性达到99%。重组酶与组氨酸标签融合表达,经镍柱亲和层析纯化出融合蛋白,电泳显示出56 kDa的目的条带,纯化的重组酶表现出了酶活性(1.06 U/mg)。

体检人群甲状腺自身抗体与抗谷氨酸脱羧酶抗体的相关性研究

背景自身免疫性甲状腺疾病和自身免疫性糖尿病常同时存在,而自身免疫性糖尿病患者继发甲状腺抗体(TA)阳性的风险升高。目的研究我国体检人群中TA与抗谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)的关系。方法检索北京协和医院健康管理数据库,查询2012-2015年在北京协和医院进行健康体检并检测GADA和TA的人群,收集其体检资料和GADA、促甲状腺激素、甲状腺球蛋白抗体(TgAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)水平,其中TPOAb、TgAb任一阳性记为TA阳性。比较TA阳性与阴性人群GADA阳性率,糖尿病与非糖尿病人群TA、GADA阳性率;分析GADA阴性、低滴度、高滴度人群的一般资料,探究体检人群TA阳性、TPOAb阳性、TgAb阳性的影响因素。结果共36048例体检人群符合纳入标准,其中TA阳性5000例(13.9%)[TPOAb阳性3321例(9.2%)、TgAb阳性3552例(9.9%)],TA阴性31048例(86.1%);符合糖尿病诊断2600例(7.2%),不符合33448例(92.8%);GADA阳性185例(0.5%),GADA阴性35863例(99.5%)。TA阳性人群中GADA阳性率[51例(1.0%)]高于TA阴性人群[134例(0.4%)](χ^(2)=29.203,P<0.001)。糖尿病人群中TA阳性率[280例(10.8%)]低于非糖尿病人群[4720例(14.1%)],GADA阳性率[31例(1.2%)]高于非糖尿病人群[154例(0.5%)](χ^(2)值分别为22.558、25.310,P<0.001)。GADA阴性、低滴度、高滴度体检人群中TA阳性率逐步递增(分别是13.8%、23.7%、39.1%)(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示:年龄[OR=1.015,95%CI(1.012,1.018)]、性别[女:OR=3.483,95%CI(3.259,3.723)]、糖尿病[是:OR=0.837,95%CI(0.731,0.958)]、GADA[低滴度:OR=1.900,95%CI(1.266,2.853);高滴度:OR=4.259,95%CI(2.260,8.025)]是体检人群TA阳性的影响因素(P<0.05)。结论我国体检人群中GADA阳性率较低,GADA阳性与TA阳性存在相关性。

2型糖尿病患者谷氨酸脱羧酶抗体检测的临床意义

目的:探讨2型糖尿病(T2DM)患者检测谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)的临床价值。方法:对180例GADA阴性的T2DM患者,70例GADA阳性的T2DM患者测定其糖化血红蛋白(HbA1c)以及空腹和口服75g葡萄糖120min时的血C-肽水平。结果:GADA阳性组空腹及120minC-肽水平均低于GADA阴性组;HbA1c值高于GADA阴性组。结论:GADA测定对于及早发现T2DM患者胰岛β细胞功能损伤和预报成人晚发性自身免疫性糖尿病(LADA)有重要价值;并为临床提示有效的诊断、治疗方向。

谷氨酸脱羧酶抗体测定在糖尿病中的临床意义

目的:探讨谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)与糖尿病的关系。方法:应用酶联免疫吸附分析(ELISA)方法测定128例糖尿病患者血清GADA。结果:1型糖尿病总的GADA阳性率74.3％,其中1型糖尿病急性发病组和缓慢发病组的阳性率分别为73.1％和75.0％,组间无差异(P>0.05);但均高于2型糖尿病GADA阳性率12.9％(P<0.01)。结论:GADA是1型糖尿病自然病程中β细胞功能损伤的一个预测指标,对糖尿病的早期诊断,病因分型及指导治疗具有一定意义。

吗啡引起大鼠纹状体抗坏血酸释放的谷氨酸能机制探讨

目的 观察谷氨酸能神经系统对吗啡引起大鼠纹状体抗坏血酸(AA)释放的影响,进一步探讨AA在脑内的作用机制。方法 应用脑微透析技术结合高效液相色谱 电化学法(HPLC ECD)检测。结果 (1)吗啡(2 0mg·kg-1,ip)显著增加大鼠纹状体抗坏血酸释放(P <0 .0 0 1) ;(2 )MK 80 1(1.0mg·kg-1,ip)显著降低大鼠纹状体抗坏血酸的基础释放(P <0 .0 0 1) ,同时MK 80 1可明显抑制吗啡引起的大鼠纹状体抗坏血酸释放(P <0 .0 0 1) ,两因素方差分析表明:MK 80 1与吗啡对大鼠纹状体抗坏血酸的释放有交互作用(P <0 .0 5 ) ;(3)大鼠去前额皮层后,吗啡对大鼠纹状体抗坏血酸释放的升高作用消失,两因素方差分析表明:去皮层与吗啡对大鼠纹状体抗坏血酸的释放有交互作用(P <0 .0 0 1)。结论 吗啡引起的抗坏血酸释放与中枢谷氨酸能神经系统有关,皮层-纹状体谷氨酸能神经通路的完整性,是吗啡引起的大鼠纹状体抗坏血酸释放的必要条件。

高产γ-氨基丁酸的富锌乳酸菌培养基优化及gad基因的克隆和序列分析

为了检测和提高乳酸菌γ-氨基丁酸(GABA)产量,本研究采用纸层析预染法分析Lactobacillus brevis BS2最佳发酵产GABA条件为:pH5.0,以葡萄糖为碳源,以大豆蛋白胨和牛肉膏为复合氮源,碳氮比为1:1,底物质量分数1%,GABA产量可达到6.32g/L。采用CTAB法提取该菌株基因组,并以此基因组为模板应用降落PCR扩增出1407bp的谷氨酸脱羧酶基因gad,将gad克隆到T载体后经测序分析发现与L.brevis strain BH2的gad具有高度的同源性,同源性达98%,证明该菌株为高产GABA的富锌短小乳酸杆菌,在工业应用方面具有很大潜力。

籼稻GAD基因的克隆、序列分析及其植物表达载体构建

【目的】克隆籼稻谷氨酸脱羧酶(GAD)基因的全长cDNA,并进行序列分析和植物表达载体构建,为改良水稻的营养保健品质奠定基础。【方法】根据已知植物GAD基因的保守区域设计引物,以高GABA籼稻品系"新-9-4"的胚芽为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆GAD基因的全长cDNA;扩增其编码序列,构建双T-DNA植物表达载体。【结果】扩增获得长1962bp的籼稻GAD基因全长cDNA(OsiGAD),包含1479bp的开放阅读框,编码492个氨基酸。OsiGAD与已报道的水稻GAD基因OsGAD1、OsGAD2、OsGAD3的核苷酸序列同源性分别为67.1%、69.4%、98.3%,推导氨基酸序列的同源性分别为77.6%、70.1%、100.0%。OsiGAD蛋白序列具有磷酸吡哆醛结合位点和与钙调蛋白结合的C端延伸区域;构建了其具有水稻胚乳特异表达特性的双T-DNA植物高效表达载体pCDMAR-OsiGAD-hpt,选择标记基因和OsiGAD基因分别位于此载体的两个不同T-DNA区。【结论】克隆获得的籼稻GAD基因OsiGAD长1962bp,并成功构建了其双T-DNA植物高效表达载体。

自杀行为中5-HT基因和GAD1基因的交互作用

目的初步探讨5-羟色胺受体2C(5-HTR2C)基因、单胺氧化酶A(MAOA)基因和谷氨酸脱羧酶(GAD1)基因多态性与自杀行为的关系,并分析基因-基因之间的交互作用。方法对中国人群中21例有自杀行为史病例样本和50例健康对照者进行基因型分型;采用多因子降维法进行交互作用分析。结果对照组符合哈温平衡(HWE)检验,病例组中5-HTR2C位点不符合HWE检验(P<0.05),经过性别矫正检验显示与自杀行为正相关;两组的5-HTR2C基因型频率差别有统计学意义(χ~2=6.18,P=0.04);病例组和对照组MAOA、GAD1基因型频数差异均无显著统计学意义(P>0.05)。在MDR模型分析得到最优模型组合为rs5953210-rs769391位点构建的交互模型OR=20.19,95%CI4.19~97.38,P<0.01,交互作用显著。结论 5-HTR2C基因rs3813928、rs518147位点多态性可能与自杀行为存在关联,与GAD1基因rs3749034、rs769391位点和MAOA基因rs5953210、rs979605位点无关联。在MDR模型中,5-HTR2C基因与MAOA基因在自杀行为发病中具有显著交互效应,可增加自杀行为的发病风险。

响应面法优化屎肠球菌T2-2产γ-氨基丁酸的发酵条件

从传统腌制芥菜中筛选获得高产γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的屎肠球菌T2-2为研究对象,通过单因素实验和响应面法优化菌株发酵条件,提高GABA产量。结果表明:屎肠球菌T2-2产GABA最佳发酵条件为:温度30℃,屎肠球菌T2-2添加量7.50%,L-谷氨酸钠添加量18.93 g/L,pH 6.0,时间1 d,此时菌体生长量为0.338,酶活为3.177μg/mL,GABA产量为1.190 mg/mL,较优化前提高63.01%。本研究为提高乳酸菌产GABA含量提供一定的理论依据。

棉花种子萌发期耐盐机理初探

以5个耐盐性不同的棉花品种(系)为供试材料,研究了萌发期盐胁迫对不同基因型棉花种子萌发相关指标、谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase, GAD)活性、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)含量和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)含量等的影响。结果表明,盐胁迫显著抑制了不同棉花材料的相对发芽率、根长、种子活力指数和ATP含量,延长了种子的平均发芽时间,提高了GAD活性和GABA含量。不同基因型比较,萌发期盐胁迫下,新陆中82号和中棉9001的种子保持较高的GAD活性,从而通过GABA途径为种子萌发提供更多的ATP,耐盐性最好;塔河2号和中棉所49的种子耐盐性次之,中J0102的种子耐盐性最差。通径分析表明,种子活力指数和ATP含量均对根长有显著的正效应,其中ATP含量对根长的促进效应更强。盐胁迫下,通过有效调节GABA途径生成ATP可能是种子萌发期提高棉花耐盐性的重要机理之一。

牡丹花不同发育时期脂质过氧化代谢的相关性研究

【目的】分离纯化米胚芽谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase,GAD）,并对其酶学性质进行研究。【方法】通过（NH4）2SO4分级沉淀、DEAE-Sephrose FF离子交换色谱、Superdex 200凝胶过滤色谱和Glu SephroseCL 4B亲和色谱等分离纯化技术,对米胚芽GAD进行分离纯化。用体积排阻高效液相色谱测定米胚GAD的相对分子质量,SDS-PAGE测定其亚基的相对分子质量。测定米胚GAD的最适温度和pH,通过酶动力学试验测定其动力学常数（Km）和最大反应速度（Vmax）,并测定KCl和MgSO4等化学物质对酶活性的影响。【结果】分离纯化得到了米胚GAD,其纯化倍数为65.7,比活达223.4 U/mg,酶活回收率为10.8%。米胚GAD的相对分子质量为78 ku,亚基相对分子质量为40 ku,说明米胚GAD是由2个相同亚基构成的二聚体。米胚GAD的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.6;米胚GAD的热稳定较差,80℃时酶几乎完全失活;米胚GAD在pH 4.5-8.0较为稳定,能保持88%以上的酶活。米胚GAD对谷氨酸Glu的Km为32.3 mmol/L,Vmax为1.159 mg/min;对磷酸吡哆醛（PLP）的Km为1.7μmol/L,Vmax为1.171 mg/min。K＋和Ag2＋对米胚GAD的活力有较大抑制,Mg^2＋、Mn^2＋、Al^3＋和Li^2＋等对活性影响不大,500μmol/L Ca^2＋对米胚GAD有较强的激活作用。【结论】米胚GAD的性质与其他植物GAD存在差异。

大肠杆菌酶的信息

大肠杆菌酶(即谷氨酸脱羧酶)是谷氨酸发酵厂测定谷氨酸的必须用酶,酶活性强弱直接影响到谷氨酸测定效果,质量差的大肠杆菌酶反应时间长,反应不完全,造成分析误差,给生产判断造成失误。为此,我们对提高大肠杆菌酶活性进行了大量研究,终于摸索出培养大肠杆菌的最佳条件和最优提取工艺,因而制得了酶活性强。