表达元件优化促进重组胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中的表达

重组胶原蛋白是一种具有广泛应用潜力的生物材料,近年来引起了生物医学、组织工程等众多领域的关注。胶原蛋白的3股螺旋结构赋予其独特的生物学功能和生物相容性,但也增加了其在微生物系统中表达的复杂性。该研究以细菌胶原蛋白V-B作为模式蛋白,通过对表达元件的优化,促进重组胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中的表达。首先通过启动子筛选和发酵时长优化,获得介导V-B表达的最优启动子tac-R0。接着利用RBS calculator设计核糖体结合位点(ribosomal binding site,RBS)和间隔序列(aligned spacing,AS)的突变文库,得到与tac-R0启动子搭配组合的最优RBS和AS,使V-B的产量提高至514 mg/L。此外,通过多基因表达盒的串联组合策略,将多个目的基因串联,最终V-B的产量较初始水平提高了8.4倍,达697 mg/L,该研究为重组胶原蛋白的工业化生产提供了基础。

糖尿病患者餐后高血糖与谷氨酸脱羧酶抗体、β2-微球蛋白和HbA1c的测定

目的探讨糖化血红蛋白与慢性并发症的关系。方法将50例Ⅱ型糖尿病患者根据HbA1c分为观察组和对照组，并测定餐后血糖HbA1c，β2-微球蛋白和谷氨酸脱羧酶抗体。结果HbA1c及餐后血糖偏高组β2-MG高于对照组。结论Ⅱ-DM肾病发病机制很多，长期高血糖是最重要的因素。HbA1c是血红蛋白非酶促糖基化的早期产物，与血糖升高有关，不仅是高血糖变化的判断指标，可能也参与了微血管的损伤过程，谷氨酸脱羧酶抗体是胰腺β细胞功能损伤的一个预测指标，结合HbA1c测定有助于对糖尿病的诊断与疗效监测。

大鼠谷氨酸脱羧酶(GAD)毕赤酵母表达重组子的构建

目的 :构建大鼠谷氨酸脱羧酶(glutamicaciddecarboxylase,GAD)巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达重组子 ,探索一条真核细胞高效表达rGAD的新途径。方法 :以 pUC18_GAD质粒为模板PCR扩增出大鼠GAD65基因 ,将其克隆入PGEM_Teasy载体 ,继而将其克隆到毕赤酵母分泌型质粒表达载体 pPIC9K中 ,重组质粒线性化后PEG法转染入毕赤酵母菌株GS115,PCR筛选转化子。结果 :DNA序列分析和PCR鉴定表明成功构建了大鼠谷氨酸脱羧酶 (GAD)毕赤酵母表达重组子。结论

基于T7转录系统的谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的创建

本研究以前期构建的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pAU2为基础,通过添加T7 RNA聚合酶编码基因及人工合成的克隆表达区,构建了1个新的谷氨酸棒杆菌分泌型基因高效表达载体pAU29KS。pAU29KS载体克隆/表达盒使用T7启动子作为目的基因的启动子,通过载体序列中T7 gene 1基因编码的T7 RNA聚合酶与T7启动子互作来进行目的基因的高效转录;启动子区下游使用谷氨酸棒杆菌核糖体结合位点RBS保守序列(gaaagga)来高效起始目的蛋白合成;克隆/表达盒RBS与多克隆位点MCS之间使用谷氨酸棒杆菌强信号肽cgl_2070编码序列来进行目的蛋白的胞外高效分泌。以嗜热脂肪土芽孢杆菌的α-淀粉酶AmyF作为报告蛋白,进行谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pAU29KS表达系统的蛋白分泌生产能力检测。透明圈法检测结果显示,工程菌株C.glutamicum/pAU29KS-amyF能够在淀粉平板上产生清晰可见的透明圈;培养物上清液的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和Western Blotting检测结果都显示出清晰的特异性条带,与AmyF预测分子量相一致;淀粉酶活性检测结果显示,培养物上清液呈现高淀粉酶活力,而细胞裂解上清液未检测到淀粉酶活力,说明高效表达的α-淀粉酶在强信号肽cgl_2070的介导下完全分泌到胞外培养基中。本研究构建的基于T7转录系统的C.glutamicum/pAU29KS能够对目标蛋白进行高效分泌生产,是一套新的谷氨酸棒杆菌分泌型重组蛋白表达系统。

表达谷氨酸脱羧酶重组枯草芽孢杆菌的构建及其发酵条件的优化

谷氨酸脱羧酶(GAD)是生物合成γ-氨基丁酸(GABA)的关键酶,本研究通过基因工程构建了一株产GAD的重组枯草芽孢杆菌,并对其产GAD的发酵条件进行优化。分别通过单因素法、正交实验、极差分析和响应面法确定了最佳培养基成分(g/L)及发酵条件为:蔗糖23.5,豆粕10、乙酸铵为8.5、磷酸二氢钾4.1、七水硫酸镁0.5,p H7.0,培养温度37℃。在优化条件下GAD酶活达到0.413 U/m L,与优化前的GAD酶活0.143 U/m L相比,酶活提高了188.8%。本研究有助于后续开发枯草杆菌生产γ-氨基丁酸的工艺,以克服现在γ-氨基丁酸生产工艺中,大肠杆菌安全性的问题和乳酸菌成本过高的问题。

糖化血红蛋白与血糖、谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛细胞抗体的检测在糖尿病中的临床应用价值

目的探讨糖化血红蛋白(HbA1c)与血糖、谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、胰岛细胞抗体(ICA)的检测在糖尿病中的临床应用价值。方法采用己糖激酶法检测血糖,亲和层析金标定量法检测HbA1c,ELISA法检测GADA和ICA。结果 HbA1c与血糖、GADA、ICA的检测,在1型糖尿病(IDDM)和2型糖尿病(T2DM)、单纯应激性高血糖、妊娠糖尿病(GDM)中,1型糖尿病的GADA阳性率和ICA阳性率分别为63.33%与43.33%,与其他组间比较,经配对t检验,P<0.01差异有显著性统计学意义;孕24～28周妊娠糖尿病组与健康孕妇对照组比较HbA1c、空腹血糖、服糖后1h血糖、2h血糖,经配对t检验,P<0.01差异有显著性统计学意义,通过绘制HbA1c诊断GDM的ROC曲线下面积,HbA1c诊断GDM的最佳cutoff值为5.1%。与健康对照比较,受控8周以上的糖尿病组HbA1c、空腹血糖含量经配对t检验,P>0.05差异无统计学意义。糖尿病微血管并发症组与糖尿病无微血管并发症组间比较,HbA1c含量经配对t检验,P<0.01差异有显著统计学意义。结论 HbA1c与血糖、GADA、ICA的检测,结合临床表现,对IDDM的预测、诊断和病因探讨具有重要临床应用价值.HbA1c诊断GDM的最佳cutoff值为5.1%,此cutoff值该方法诊断GDM可能会有更好的效果。HbA1c的检测是糖尿病微血管并发症的发现、预防并降低糖尿病微血管并发症危险性的重要实验依据,HbA1c水平是监控糖尿病患者治疗效果的良好指标。

重组谷氨酸脱羧酶的表达条件优化、纯化及酶学性质研究

为了利用从γ-氨基丁酸(GABA)高产菌株——短乳杆菌Lactobacillus brevis CGMCCNO.1306中克隆并表达的谷氨酸脱羧酶进行GABA的生物制备,研究了影响重组工程菌E.coliBL21(pET28α(+)-gad)生长的培养基组成和攸关GAD表达水平的诱导条件,优化了这些关键因素,提高了重组GAD的表达水平。采用Ni-NTA亲和纯化方法实现了对所得重组GAD的纯化,获得了纯酶,并确定了重组GAD产生GABA的最适pH值和温度,为该酶的工业应用创造了条件。

大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶定点突变及其酶学性质初步研究

L-谷氨酸脱羧酶（L—glutamate decarboxylase，GAD）是生物法生产GABA的关键酶，但是野生型L-谷氨酸脱羧酶的最适pH过低，这限制了它的工业应用。本文对编码来源于大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的gadB基因进行了定点突变，分别构建了表达野生型GadB和突变型GadBAHT的基因工程菌。在获得高表达的基础上，对两个酶的最适温度、最适pH、温度稳定性和pH稳定性进行了系统研究，证实了突变酶GadBAHT在保持了与野生型相当的催化活性的前提下，表现出更广泛的pH适应能力，在pH3．4～6．2的范围内，仍能保持50％以上的催化活性。突变酶更能适应工业生产的需要，降低生产成本，对于实际应用具有重要价值。

谷氨酸脱羧酶基因工程改造研究进展

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种具有重要生理功能的天然氨基酸,广泛应用在医药、食品、化工等行业。利用谷氨酸脱羧酶催化法合成GABA因其反应条件温、对环境友好和原料易得已成为当前研究的热点。该研究论述了催化合成GABA关键酶谷氨酸脱羧酶的分子改造、基因工程菌构建等研究进展。

利用荧光光谱法研究脲和盐酸胍诱导谷氨酸脱羧酶的去折叠

利用荧光光谱法研究了盐酸胍和脲诱导的谷氨酸脱羧酶野生酶和突变酶K413A的去折叠过程,以探索与酶稳定性相关的构效关系。以盐酸胍为变性剂时,野生型酶和突变酶K413A在激发波长为280 nm的荧光图谱中色氨酸的最大发射峰均发生红移,色氨酸荧光强度呈现先上升再下降的趋势;以脲为变性剂时,两种酶荧光图谱中色氨酸的最大发射峰同样发生红移,但色氨酸荧光强度持续下降。无论是以盐酸胍还是以脲作为变性剂时,野生型酶和突变酶K413A的去折叠过程都符合"三态模型",说明随着变性剂浓度的增加,野生型酶和突变酶K413A先从天然态转变为部分折叠中间态,并最终转变为去折叠状态。此外,考察了变性剂对谷氨酸脱羧酶活力的影响,当以盐酸胍为变性剂时,野生型酶和突变酶K413A半失活的盐酸胍浓度分别为0.4 mol×L^(-1)和0.7 mol×L^(-1),而半失活的脲浓度分别为1 mol×L^(-1)和2 mol×L^(-1)。研究表明,突变酶K413A的热力学稳定性比野生型酶更强,K413位点与GAD的结构刚性有重要联系。

2型糖尿病患者谷氨酸脱羧酶抗体检测的临床意义

目的:探讨2型糖尿病(T2DM)患者检测谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)的临床价值。方法:对180例GADA阴性的T2DM患者,70例GADA阳性的T2DM患者测定其糖化血红蛋白(HbA1c)以及空腹和口服75g葡萄糖120min时的血C-肽水平。结果:GADA阳性组空腹及120minC-肽水平均低于GADA阴性组;HbA1c值高于GADA阴性组。结论:GADA测定对于及早发现T2DM患者胰岛β细胞功能损伤和预报成人晚发性自身免疫性糖尿病(LADA)有重要价值;并为临床提示有效的诊断、治疗方向。

2型糖尿病谷氨酸脱羧酶抗体与CRP的关系

目的 探讨 2型糖尿病中谷氨酸脱羧酶抗体 (GAD -Ab)与急性时相反应标记物之一C -反应蛋白 (CRP)之间的联系。 方法 对 1 1 2例 2型糖尿病患者进行GAD -Ab和CRP测定。 结果 GAD-Ab阳性组其CRP值较GAD -Ab阴性组明显升高。 结论 炎症是与胰岛 β细胞功能和结构缺陷有关的自身免疫反应的一部分。胰岛细胞自身免疫反应的存在是与急性时相胰岛素分泌的紊乱有关的。

饱和定点突变拓宽谷氨酸脱羧酶催化pH范围的研究

谷氨酸脱羧酶(GAD)是生物法制备γ-氨基丁酸GABA以及一些含氮化合物的关键酶,其催化活力受p H值调控。研究GAD的pH值调控性质具有重要的理论和应用价值。研究通过氨基酸序列比对,发现了一个影响GAD 1407催化p H特性的关键位点:S307。通过对这个位点进行饱和突变,构建突变文库,从中筛选出催化pH范围拓宽的突变酶S307N,并对该突变酶的酶学性质进行了研究。为了解GAD 1407结构与功能之间的相互关系提供了一定的依据。

谷氨酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的表达及应用

为了研究在枯草芽孢杆菌发酵过程中添加相对廉价的辅酶前体对谷氨酸脱羧酶(GAD)酶活力和催化效率的影响,将来源于Escherichia coli的谷氨酸脱羧酶基因gadB,通过构建重组质粒pHY300PLK-gadB,在枯草芽孢杆菌中重组表达,得到重组菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB。研究了分别在重组菌发酵过程中添加辅酶磷酸吡哆醛(PLP)、辅酶前体吡哆醛(PL)和吡哆醇(PN)对GAD酶活力的影响。当设置摇床转速200 r/min,发酵温度33℃,发酵培养基初始pH 7.0时,在发酵过程中分别添加PLP、PL、PN至终浓度0.5 mmol/L,诱导48 h后发酵液中总酶活分别达到25.40、28.14、15.55 U/mL,是对照总酶活的1.55、1.72、0.95倍。基于以上结果,进一步研究了发酵过程中PL的添加浓度对重组菌生长情况及GAD表达的影响。结果表明,发酵液中GAD总酶活随着PL浓度的增加而增加,当PL浓度为0.1 mmol/L时,总酶活最高达到28.28 U/mL。利用重组菌全细胞制备γ-氨基丁酸(GABA),结果表明,最适转化pH为5.0,最适转化温度为40℃,发酵过程中添加PL的重组菌(简称“GAD-PL”)和发酵过程中不添加任何辅酶及辅酶前体的重组菌(简称“GAD-0”)的最适加菌量(以酶活力单位计)分别是40 U/g(以谷氨酸计)和50 U/g(以谷氨酸计),当谷氨酸最终质量浓度达到400 g/L时,得到的GABA质量浓度分别为275.60 g/L和273.61 g/L。

植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆及原核表达

根据Gen Bank中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)基因组序列设计引物,利用PCR技术扩增了植物乳杆菌QL-14的谷氨酸脱羧酶编码基因gad B,克隆至表达载体p GEX-4T-3,转化大肠杆菌(Escherichia coli)后进行原核表达,对表达条件进行了优化并对表达蛋白质进了纯化。结果表明,扩增目的gad B基因的开放阅读框(ORF)全长1 407 bp,编码469个氨基酸,氨基酸序列与植物乳杆菌WCFS1同源性为99.6%。通过优化诱导表达条件,得到纯化蛋白质GAD大小为53.6 ku,等电点为5.58,比活力为9.9 U/mg。

赖氨酸-尸胺反向转运蛋白cadB基因谷氨酸棒杆菌表达载体的构建及转化

旨在提高谷氨酸棒杆菌合成尸胺的能力,将CadB克隆至谷氨酸棒杆菌中,与LDC共表达,在谷氨酸棒杆菌合成尸胺的同时,帮助尸胺转运至细胞外,解除尸胺的反馈抑制作用。谷氨酸棒杆菌能够高产赖氨酸脱羧酶的底物L-赖氨酸,但不含ldc和cadB基因,因而不能够直接合成尸胺。从E.coliK12中克隆出赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因,与绿色荧光蛋白基因gfp融合构建成融合表达载体pXBG,并转化至谷氨酸棒杆菌进行诱导表达,结果表明表达的CadB蛋白可以正确的定位于谷氨酸棒杆菌的细胞膜上。将基因cadB连接到含有赖氨酸脱羧酶基因的pXMJ19-ldc上,构建成能够共表达赖氨酸脱羧酶和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白的重组质粒pXLB,并转化到谷氨酸棒杆菌中。

信号肽及发酵条件优化促进胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中分泌表达

胶原蛋白独特的三股螺旋结构,使其具有良好的力学性能和生物相容性,在生物医学材料等方面有广泛应用。利用微生物表达重组胶原蛋白,具有发酵周期短、成本低、便于遗传操作等优点,近些年发展迅速,但分泌带有三股螺旋结构的重组胶原蛋白仍是研究的难点。该研究以来源于化脓性链球菌的胶原蛋白V-B为对象,搭建了谷氨酸棒杆菌分泌表达重组胶原蛋白的平台。在重组胶原蛋白V-B前端引入6种不同信号肽(CspB、PorB、Cg1514、CgR0949、Cg2052或TorA),构建重组表达载体,并转入食品级表达宿主谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032中,结果显示PorB信号肽介导的分泌效果最好。此外,对PorB信号肽介导的分泌表达进行培养基、起始诱导菌浓度、诱导时长、IPTG浓度、溶氧的优化,最终胶原域B在摇瓶水平产量达到30 mg/L,是优化前的3倍,并通过圆二色谱表征,验证其正确折叠为三股螺旋。该研究为重组胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中的高效分泌表达奠定了基础。

乳酸乳球菌谷氨酸脱羧酶B重组质粒的构建、异源表达及酶学性质的研究

目的:旨在研究乳酸菌谷氨酸脱羧酶B(Decarboxylation of glutamic acid,gadB)的异源表达及其酶学性质。方法:以Lactocus lactis subsp.lactis Il1403的gadB基因序列为目的基因,实现gadB在大肠杆菌中的异源表达,探究其酶学性质,实现高效催化合成γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)。结果:重组菌经IPTG诱导gadB过量表达后,进一步采用Ni^(2+)亲和层析纯化gadB,经SDS-PAGE分析,在54 ku处出现明显条带,经检测可溶性蛋白含量约占70%。对酶学性质进行研究,gadB的最适pH值为4.8,最适反应温度为40℃,Na^(+)和Mn^(2+)限制gadB的酶活力,而Mg^(2+)和Zn^(2+)明显刺激酶活。对酶底物浓度进行研究,谷氨酸脱羧酶B的K_(m)为123.83 mmol,V_(max)为0.79 mmol/min。结论:该研究探索了gadB的酶学性质,为基因工程菌工业化生产γ-氨基丁酸提供了实验基础。

NADPH依赖型谷氨酸脱氢酶的辅酶特异性改造

基于结构信息及保守序列比对,通过半理性设计和高通量筛选,将来源于Pseudomonas putida的NADPH依赖型谷氨酸脱氢酶PpGDH改造为NADH依赖型。与原始PpGDH相比,突变体PpGDH-D264V对NADH的偏好性(Ratio of k_(cat)/K_(m))增强了1607倍,并具有对多种酮酸底物的催化活力,可用于制备多种非蛋白质氨基酸。对PpGDH-D264V进行酶学性质表征,其最适温度为45℃,最适pH值8.0,T_(1/2)^(10 min)温度达到58.1℃,在中性及弱碱性环境下具备良好的稳定性,为后续应用奠定基础。