NPPB和尼弗灭酸对H_2O_2损伤C6胶质细胞谷氨酸半胱氨酸合成酶及CLIC4表达的影响

目的:观察氯通道阻断剂5-硝基-2-(3-苯丙胺)-苯甲酸(NPPB)、尼弗灭酸(NFA)对H2O2诱导的神经胶质瘤C6细胞损伤的影响。方法:MTT法检测NPPB、NFA、H2O2作用的C6细胞生存率;紫外分光光度法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率以及谷胱甘肽GSH水平;RT-PCR检测谷氨酸半胱氨酸合成酶(GCL)亚单位GCLC、GCLM及线粒体氯通道(CLIC4)mRNA表达;Western blotting检测CLIC4的蛋白水平。结果:与对照组相比,H2O2组C6细胞存活率和GSH含量明显降低;LDH释放率增加;GCLC、GCLM、CLIC4 mRNA表达降低;CLIC4蛋白水平明显增强。NPPB或NFA与H2O2联合作用于C6细胞组,与单独应用H2O2组相比,细胞存活率和GSH含量未见明显变化;LDH释放率降低;GCLC、GCLM mRNA表达未见明显差异;CLIC4蛋白表达下降。结论:氯通道阻断剂NPPB或NFA能够在一定程度上减轻氧化应激引起的C6细胞损伤,可能与调节细胞膜功能和下调CLIC4蛋白表达有关。

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶在溃疡性结肠炎患者结肠黏膜中的表达

背景：溃疡性结肠炎（uc）的黏膜损伤与氧化应激相关。谷胱甘肽（GSH）是细胞内最重要的抗氧化剂，γ-谷氯酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是其合成的关键酶。目的：探讨UC患者结肠黏膜中γ-GCS表达。方法：选取2007年8月～2009年12月北京军区总医院的30例UC患者，以26例健康者作为对照，应用免疫组化法检测结肠黏膜中γ-GCS的表达：结果：γ-GCS主要表达于腺体细胞胞质内，UC组γ-GCS表达显著低于对照组（53．3％对92.3％，P〈0．01）。结论：UC患者结肠黏膜中γ-GCS表达显著降低，说明其存在氧化应激失衡，且GSH合成减少可能与γ-GCS低表达有关.

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶在吸烟气道上皮细胞表达的研究

目的通过观察吸烟大鼠支气管上皮细胞及慢性吸烟人气道上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)表达的研究,探讨γ-GCS在吸烟所致慢性气道炎症及氧化/抗氧化失衡中的作用。方法①自制大鼠实验性被动吸烟装置,建立吸烟引起慢性气道炎症的动物模型,将40只大鼠随机分为不吸烟组、吸烟1个月组、吸烟2个月组、吸烟3个月组,每组各10只;②选择2007年9月至2008年10月行支气管镜检查的患者60例。吸烟指数>300支,平均年龄(50±10)岁,分为吸烟组(慢性支气管炎组、非慢性支气管炎组),不吸烟组(慢性支气管炎组、非慢性支气管炎组),每组各15例。通过支气管镜刷检获取支气管气道上皮细胞,分别采用免疫组织化学、免疫细胞化学法检测支气管上皮细胞中γ-GCS蛋白的表达水平。结果 (1)吸烟3个月组大鼠出现了肺气肿的病理改变;吸烟1个月、2个月和3个月组大鼠支气管上皮细胞γ-GCS蛋白表达水平明显高于不吸烟组(均P<0.01)。(2)在气管镜下取人气道上皮细胞γ-GCS蛋白的表达:①吸烟组[慢性支气管炎组(0.20±0.10)、非慢性支气管炎组(0.35±0.11)]的气道上皮细胞γ-GCS的表达水平,低于不吸烟组[慢性支气管炎组(0.40±0.10)、非慢性支气管炎组(0.50±0.15)]差异均有统计学意义(P均<0.05);②慢性支气管炎组(0.40±0.10)的气道上皮细胞γ-GCS的表达水平,低于非慢性支气管炎组(0.50±0.15)的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论①随着吸烟时间的延长,大鼠支气管上皮细胞中γ-GCS蛋白表达水平逐渐增高;②吸烟者气道内上皮细胞γ-GCS的免疫活性降低,γ-GCS在不吸烟非慢性支气管炎者表达最强,而在吸烟者与慢性支气管炎者的气道内表达下调;γ-GCS在香烟所致慢性气道炎症、氧化应激及氧化/抗氧化失衡中可能发挥一定的作用。

同型半胱氨酸对谷胱甘肽合成的抑制作用

目的:探讨同型半胱氨酸对谷胱甘肽合成的影响及其发生的可能原因。方法:实验于2004-08/2005-02在新乡医学院生物化学与分子生物学实验室进行。选用健康家兔20只,取抗凝血,离心收集红细胞,制备含有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶体系的红细胞裂解液,设置对照组,高、低剂量同型半胱氨酸处理组,每组均设8个平行管。各组均加入100mmol/L的Tris-Hcl缓冲液(pH8.0)60μL,1mol/LMgCl28μL,10mmol/LATP40μL,50mmol/L谷氨酸(调pH为中性)40μL,红细胞裂解液40μL。低、高浓度同型半胱氨酸处理组再分别加入100mmol/L同型半胱氨酸20μL和60μL,其余实验条件相同。以反应中生成无机磷的mmol数表示γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性大小。分别用紫外分光光度法和荧光法检测各组无机磷和谷胱甘肽含量。结果:①无机磷的生成量:低浓度同型半胱氨酸组和高浓度同型半胱氨酸组明显低于对照组犤(1.476±0.240),(0.751±0.085),(3.279±0.470)mmol/L,P<0.01犦,高浓度同型半胱氨酸组明显低于低浓度同型半胱氨酸组(P<0.05)。②还原型谷胱甘肽含量:低同型半胱氨酸组和高同型半胱氨酸组明显低于对照组犤(3.058±0.264),(1.908±0.301),(4.476±0.462)μmol/L,P<0.01犦,高浓度同型半胱氨酸组明显低于低浓度同型半胱氨酸组(P<0.01)。结论:同型半胱氨酸有可能通过竞争性抑制γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性,减少细胞内还原型谷胱甘肽的生成。

溴氰菊酯对大鼠脑组织某些抗氧化酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和NF-E2相关因子2基因表达的影响

目的研究溴氰菊酯(DM)对大鼠大脑皮层和海马组织铜锌超氧化物歧化酶(CuZn- SOD)、谷胱苷肽还原酶(GR)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)轻亚单位(GCSl)重亚单位(GCSh)基因和红系核因子2(NF-E2)相关因子2(Nrf2)基因表达的影响。方法将18只大鼠随机分为3组,每组6只,对照组腹腔注射橄榄油,低剂量DM染毒组(3．125 mg／kg体重)和高剂量DM染毒组(12．500 mg／kg体重)大鼠染毒5 d。分别用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法测定CuZn-SOD、GR、GCSI、GCSh和Nrf2基因mRNA表达的相对量。12只大鼠随机分为3组,用免疫组织化学方法检测海马和大脑皮层中γ-GCS重亚单位蛋白(GCS-HS)和Nrf2蛋白水平。结果DM染毒大鼠大脑皮层和海马组织中的CuZn-SOD、GR、GCSh和Nrf2基因mRNA水平均未见明显改变;12．500 mg／kg组大脑皮层、3．125 mg／kg组大脑皮层和海马组织中的GCSl基因mRNA水平低于对照组中各相应组织的水平,分别降低至对照组mRNA水平的71．1％、63．6％和75．2％,差异均有统计学意义(P<0．01);DM染毒的大鼠海马CA1、CA2、CA3、齿状回和大脑皮层中的GCS-HS和Nrf2蛋白水平均未见明显改变。结论DM对GR及CuZn-SOD基因,mRNA表达未见影响;DM抑制大鼠海马和脑皮层中GCSl基因mRNA表达,而未见影响GCSh基因mRNA的表达;本实验条件下DM对大脑皮层和海马组织中的Nrf2表达无明显影响。

普罗布考对高糖培养人视网膜Müller细胞特化蛋白1/细胞骨架相关蛋白/核因子E2相关因子2/半胱氨酸连接酶催化亚基表达的影响

目的观察普罗布考对高糖环境下人视网膜Müller细胞中特化蛋白1(SP1)/细胞骨架相关蛋白(Keap1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)表达的影响;初步探讨普罗布考的抗氧化作用。方法体外培养的人Müller细胞分为正常糖组(5.5 mmol/L)、高糖组(25.0 mmol/L)、正常糖+普罗布考组、高糖+普罗布考组;后两组中加入100 μmol/L普罗布考。免疫荧光染色法鉴定Müller细胞;免疫荧光染色法和实时RP-PCR(qRT-PCR)检测各组Müller细胞中SP1、Keap1、Nrf2、GCLC蛋白、mRNA的表达。两组间数据比较采用独立样本t检验。结果体外培养的人Müller细胞谷氨酰胺合成酶染色阳性率>95%。免疫荧光染色结果显示,Müller细胞中SP1、Keap1、Nrf2、GCLC蛋白均呈阳性表达。qRT-PCR结果显示,与正常糖组比较,高糖组Müller细胞中SP1(t=28.30,P<0.000)、Keap1(t=5.369,P=0.006)、Nrf2(t=10.59,P=0.001)mRNA表达显著上调,GCLC显著下调(t=4.633,P=0.010),差异均有统计学意义。与高糖组比较,高糖+普罗布考组Müller细胞中SP1(t=12.60,P=0.000)、Keap1(t=4.076,P=0.015)mRNA表达显著下调,Nrf2(t=12.90,P=0.000)、GCLC(t=15.96,P<0.000)mRNA表达显著上调,差异均有统计学意义。结论普罗布考通过抑制高糖诱导Müller细胞中SP1、Keap1的表达,上调Müller细胞中Nrf2、GCLC的表达,发挥抗氧化作用。

P13K／Akt—Nrf2信号通路调节大鼠气道上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的研究

目的观察香烟烟雾提取物（CSE）通过磷酯酰肌醇-3-激酶（PBK）／Akt—Nrf2（Nuclearfactor—E2relatedfactor）信号通路对大鼠气道上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）的影响。方法用浓度为10％的CSE对体外原代培养的大鼠气道上皮细胞进行不同时间处理及使用P13K特异抑制剂LY294002进行干预。观察CSE在不同的时间及使用LY294002干预后对Nrt2的核转位及γ-GCS的影响，用细胞免疫化学、流式术、免疫荧光及Westernblot方法检测Nrf2、p-Akt及γ-GCS的表达水平；用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测γ-GCSmRNA的表达水平；检测还原型谷胱甘肽（GSH）的含量及γ-GCS的活性。结果暴露CSE后1h，GSH含量明显低于对照组，在暴露CSE后3h和6h，GSH含量明显增高。Nrf2蛋白质在对照组主要表达在胞浆，其蛋白质表达增强，而在CSE1h、CSE3h和CSE6h组主要在胞核中表达，其蛋白质表达增强。p-Akt蛋白质在暴露CSE后1h增强，3h最强，6h减弱。p-Akt阳性细胞百分比变化趋势与其蛋白质变化趋势相同。γ—GCSmRNA和蛋白质在CSE1h、CSE3h、CSE6h组表达逐渐增强。γ—GCS活性在CSE1h、CSE3h、CSE6h组逐渐增强。预先使用LY292002，p-Akt阳性细胞百分比及蛋白质表达明显弱于CSE3h组，Nrf2胞浆蛋白质表达增强，胞核表达减弱，吖-GCSmRNA、蛋白质和活性及GSH含量均明显低于CSE3h组。相关性分析显示Nri2与γ-GCS、γ-GCS活性呈正相关（r=0．81，0．77，P〈0．05），p-AM与γ-GCS、γ-GCS活性、GSH及Nrf2呈正相关（r=0．373，0．44，0．63，0．56，P〈0．05）。结论P13K／Akt信号通路可能参与Nrf2核转位及其对抗氧化基因γ-GCS的调控。

大蒜素对大鼠肺泡上皮细胞γ谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的影响

目的观察大鼠肺泡上皮细胞(CCL149细胞系)谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)及γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γGCS)等表达变化,了解大蒜素对CCL149细胞抗氧化能力的影响。方法在以四甲基偶氮唑盐(MTT)法确定大蒜素适当作用浓度的基础上,用不同浓度大蒜素(0、0.1、1.0、5.0μg/ml)作用CCL149不同时间(6、12、24、48h),用分光光度法检测细胞内GSH、MDA的变化;用Westernblot法检测细胞内γGCS蛋白的表达,分析不同处理剂量、不同处理时间大蒜素对细胞内GSH、MDA及γGCS的影响。结果(1)大蒜素浓度≤5μg/ml不影响细胞活力。(2)大蒜素0.1、1.0、5.0μg/ml组在处理6h后细胞内GSH含量[6h组GSH含量分别为(16.45±0.69)、(16.81±0.79)、(17.80±1.10)mg/g蛋白]较对照组[(13.38±1.16)mg/g蛋白]显著增加(t=3.92～4.78,P均<0.05),MDA含量[(1.07±0.02)、(1.02±0.06)、(1.00±0.05)nmol/mg蛋白]较对照组[(1.23±0.05)nmol/mg蛋白]下降(t=5.75～6.34,P均<0.05)。细胞内GSH水平升高至24h达顶峰,48h有所下降,仍较对照组高,相同时间点不同大蒜素浓度组分别与对照组比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。(3)大蒜素0.1、1.0、5.0μg/ml组在刺激6、12、24h细胞内γGCS蛋白表达(24h为0.693±0.027、0.646±0.081、0.667±0.077)较对照组(0.531±0.007)显著增强(t=2.82～9.92,P<0.05),各观察指标未呈现剂量依赖性。结论大蒜素能增强大鼠肺泡上皮细胞的抗氧化作用,可能与其促进γGCS的表达有关。

抑制ERK1途径对支气管上皮细胞谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的影响

目的探讨抑制ERK1传导路径对支气管上皮细胞谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)合成的影响。方法用4-羟基壬烯醛(4-HNE)做刺激原,分为10μmol/L4-HNE、50μmol/LPD98059(MEK1抑制剂)孵育+10μmol/L4-HNE、正常对照组分别作用支气管上皮细胞0.5、2、4、8、12h后,检测细胞γ-GCSmRNA和蛋白的表达水平;10μmol/L4-HNE刺激细胞0.5、2、4、8、12h后,检测磷酸化JNK、P38MAPK、ERK1/2、活化蛋白-1(AP-1)活性;观察MEK1抑制剂PD98039对AP-1结合活性的影响。结果 10μmol/L4-HNE、50μmol/LPD98059孵育+10μmol/L4-HNE、正常对照组2、4、8、12h,细胞γ-GCS和γ-GCSmRNA表达三组差异有统计学意义,50μmol/LPD98059孵育+10μmol/L4-HNE较其他两组增加。10μmol/L4-HNE刺激0.5、2、4、8、12h组细胞磷酸化ERK1/2水平,AP-1结合活性较对照组增强。PD98059孵育后,4-HNE作用0.5、2、4、8、12h后,AP-1结合活性较未用PD98059孵育4-HNE刺激组降低。结论 MEK1抑制剂PD98059可以抑制支气管上皮细胞16-HBE细胞内ERK1-AP1信号传导通路,对4-HNE引起支气管上皮细胞γ-GCS合成有促进作用,阻断AP-1途径后支气管上皮细胞并不能减少γ-GCS的表达。

β萘黄酮对大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因表达的影响

目的通过了解外界刺激因子β萘黄酮（β-NF）对大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位（GCLC）基因转录的影响，研究大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ—GCS）基因转录的调节机制。方法利用大鼠GCLC基因调控序列驱动的GCLC—PGL3-enhancer—Luciferase报道载体（GCLC—Luc）转染大鼠支气管上皮细胞（RTE）和肝癌细胞（H4ⅡE），分DMSO空白对照组和不同浓度的各刺激因子组，比较各组荧光素酶值的差异以筛选影响GCLC基因转录调控的刺激因子，并比较筛选到的刺激因子β—NF对GCLC—Luc在RTE和H4ⅡE细胞内表达影响的异同。2种转染后的细胞均分为β—NF实验组（10μmol／L）和DMSO空白对照组，以荧光定量PCR检测各组的细胞内源性γ—GCS转录水平变化。分别将构建的r系列缺失报道载体、GCLC—Luc和激活蛋白1（AP-1）、NF—κB定点突变报道载体转染2种细胞，分β-NF实验组（10μmol／L）与DMSO空白对照组，比较各组荧光素酶值的变化，分析B—NF作用的调节位点和转录调控作用相关元件。结果1、10、100μmol／L的β—NF均强烈抑制RTE中GCLC基因表达，荧光素酶值显著低于DMSO空白对照组（161354-1456、27524-218、15794-294比259714-1662，均P〈0．01）。在H4ⅡE中，1、10、100μmol／L的B—NF则促进其表达，荧光素酶值显著高于DMSO空白对照组（5686±441、13601±746、13978±164比3645±367，均P〈0．01）。荧光定量PCR显示10μmol／L的β-NF作用下，RTE内源性γ—GCS的mRNA表达水平是DMSO空白对照组的0．73倍，在H4ⅡE细胞中则是1．98倍。GCLC—Luc、r系列缺失报道载体转染2种细胞后，RTE中各载体β—NF实验组荧光素酶值均低于DMSO空白对照组（P〈0．01），而H4ⅡE中则高于DMSO空白对照组（P〈0．05）。β-NF作用的调节位点定位于转录起始位点上游-390～＋2bp范嗣内。用针对该区域的AP-1、NF-κB定点突变报道载体转染细胞后，转染GCLC—Lue载体的B—NF实验组RTE荧光素酶值较DMSO空白对照组下降（91．50±0．32）％，与之相比，转染AP-1、NF-κB定点突变报道载体的细胞下降幅度并没有减少（P〉0．05）。在H4ⅡE，β—NF作用下转染GCLC—Lue载体的细胞荧光素酶值上升幅度则高于转染AP-1定点突变报道载体的细胞[（3．81±0．19）倍比（2．08±0．19）倍，P〈0．05]，而与转染NF—κB定点突变报道载体的细胞荧光素酶值上升幅度[（4．41±1．01）倍]相比差异无统计学意义（P〉0．05）。结论在大鼠RTE和H4ⅡE，β—NF影响GCLC基因的表达具有细胞特异性。在大鼠H4ⅡE，β—NF通过激活抗氧化应答元件（ARE）类似的AP-1调控GCLC基因表达。

左卡尼汀对肾脏缺血再灌注损伤中Nrf2和γ-GCS表达影响

目的研究左卡尼汀对大鼠肾脏缺血再灌注损伤中核因子相关因子2(Nrf2)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)表达的影响。方法将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组及治疗组。缺血再灌注组及治疗组建立肾脏缺血再灌注损伤模型,治疗组在缺血再灌注损伤模型建立前后尾静脉注射左卡尼汀2mL。假手术组不行缺血再灌注处理。再灌注6h后处死大鼠,取血检测血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)及胱抑素C(Cys C)的水平,并测定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。应用RT-PCR及Western-blot方法检测肾组织中Nrf2和γ-GCS的表达水平。结果治疗组Cr、BUN、Cys C及MDA水平显著低于缺血再灌注组,SOD活性显著高于缺血再灌注组(F=8.58～57.42,q=4.06～11.26,P<0.05);与假手术组相比,缺血再灌注组肾组织中Nrf2、γ-GCSmRNA及蛋白表达水平显著升高,而治疗组肾组织中上述指标较缺血再灌注组显著增高(F=143.53～241.64,q=3.76～13.51,P<0.05)。结论左卡尼汀可减轻肾脏缺血再灌注损伤,其机制可能为通过激活Nrf2-ARE通路进而诱导γ-GCS的表达而实现的。

S-腺苷甲硫氨酸对Aβ抑制谷胱甘肽生成的影响

目的研究S-腺苷甲硫氨酸（SAM）对β-淀粉样肽（Aβ）抑制谷胱甘肽（GSH）生成的影响。方法培养人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）和人胶质瘤细胞系（U87）,分为对照组、SAM处理组、Aβ处理组、Aβ＋SAM组，用Western blot方法检测谷酰胺-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）、谷酰胺-半胱氨酸连接酶调节亚基（GCLM）和谷胱甘肽合成酶（GS）的蛋白表达量，实时定量PCR方法检测GCLC和GCLM mRNA表达量，用GSH试剂盒检测细胞GSH的含量。结果SH-SY5Y细胞和U87细胞经Aβ1-42处理后，GSH含量降低，合成过程中的催化酶GCLC、GCLM和GS的mRNA和相应蛋白表达量均下降，SAM干预后，GSH含量增加，GCLC、GCLM和GS的mRNA和相应蛋白表达量增高。结论SAM可通过增加GCLC、GCLM及GS的表达，提高GSH的含量，抑制Aβ诱导的氧化应激损伤，发挥保护作用。

上调GCLM改善缺氧复氧诱导的肾小管上皮细胞铁死亡

目的探讨谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基(glutamate-cysteine ligase modifier subunit,GCLM)减轻肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤(hypoxia reoxygenation,HR)的作用与机制。方法体外培养人近端小管上皮细胞(human proximal tubular epithelial cells,HK2),分为正常对照组(Ctrl组)、缺氧复氧组(HR组)以及GCLM过表达后的缺氧复氧组(HR+GCLM OE组),其中HR组在缺氧24 h(94%N_(2)+1%O_(2)+5%CO_(2),无血清无葡萄糖的DMEM/F12培养基)后复氧6 h(95%空气+5%CO_(2)),HR+GCLM OE组在转染了GCLM过表达质粒24 h后,再缺氧复氧处理。检测各组GCLM、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的表达水平,谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)等铁死亡相关指标并通过透射电镜观察线粒体形态。结果与对照组相比,HR组丙二醛以及活性氧蓄积(P<0.01),谷胱甘肽显著降低(P<0.01),透射电镜线粒体出现铁死亡改变,同时伴随着GCLM和GPX4表达下降(P<0.01)。与HR组相比,过表达GCLM能显著缓解活性氧以及丙二醛的蓄积(P<0.01),促进谷胱甘肽的生成以及GPX4的表达(P<0.01),缓解缺氧复氧介导的肾小管上皮细胞损伤。结论上调GCLM可能通过抑制铁死亡而改善缺氧复氧损伤,提示GCLM在急性肾损伤中有着潜在的治疗作用。

脑缺血预处理对大鼠缺血再灌注损伤后抗氧化应激通路的影响

目的研究脑缺血预处理(CIPC)对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用并观察CIPC对核因子E2相关因子2(Nrf2)/γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)信号通路的影响。方法 180只雄性SD大鼠,随机分成3组:假手术组、模型组、CIPC组,每组分别在术后6、12、24、48、72h5个时间点进行神经功能评分后断头处死大鼠,并进行免疫组织化学染色,同时测定大脑皮质Nrf2、γ-GCS mRNA表达和脑组织谷胱甘肽(GSH)含量。结果模型组和CIPC组各时间点的行为学评分明显高于假手术组(P<0.01)。CIPC组缺血再灌注24、48和72h的行为学评分明显低于模型组[(2.00±0.63)分vs(2.83±0.41)分、(2.16±0.41)分vs(2.83±0.41)分和(1.17±0.41)分vs(2.00±0.89)分,P<0.05,P<0.01]。模型组与CIPC组各时间点Nrf2核转移的阳性细胞、Nrf2及γ-GCS mRNA表达明显高于假手术组,GSH含量明显低于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。CIPC组各时间点Nrf2核转移的阳性细胞、Nrf2及γ-GCS mRNA的表达、GSH含量明显高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论 CIPC通过Nrf2/γ-GCS信号通路,调节下游抗氧化应激产物的表达,保护脑缺血再灌注引起的脑组织损伤。

阻断肾素血管紧张素系统对长期高脂喂养胰岛素抵抗大鼠胰岛UCP2和GCLC表达的影响

目的:观察长期高脂喂养的胰岛素抵抗大鼠胰岛氧化应激机制以及阻断肾素血管紧张素系统(RAS)对其的影响,探讨RAS与氧化应激、糖代谢之间的关系。方法:雄性Wistar大鼠分为正常饲养组(NC组)、高脂饲养组(HF组)、高脂+培哚普利组(FP组)、高脂+替米沙坦组(FM组),后2组大鼠喂养16周后分别以培哚普利2mg·kg-1.d-1(FP组,n=15)和替米沙坦10mg·kg-1.d-1(FM组,n=15)干预,8周后行正常血糖高胰岛素钳夹试验评估外周胰岛素抵抗程度,行静脉葡萄糖耐量试验检测胰岛β细胞功能,以RT-PCR检测γ谷氨酰半胱氨酸连接酶的催化亚基(GCLC)的表达,以免疫组化法检测胰岛局部线粒体解偶联蛋白2(UCP2)水平,以比色法测定胰腺组织丙二醛(MDA)的含量。结果:与正常饲养组相比,高脂饲养组的葡萄糖输注率(GIR)降低了31.8%,胰岛GCLC表达降低了31.5%,局部UCP2相对浓度增加了17.0%,胰腺MDA含量增加了0.46倍(均P<0.01),0-10min胰岛素曲线下面积(AUC10-10)为(271.8±33.8)vs(282.7±29.8)mIU.L-1.min-1,糖刺激后早期胰岛素分泌降低,但无显著差异;培哚普利或替米沙坦干预后,GIR分别增加了27.8%和30.8%,胰岛GCLC表达分别增加了26.6%和26.6%,局部UCP2相对浓度分别下降了13.0%和15.6%,胰腺MDA含量分别下降了18%和20%(均P<0.01),FP、FM组之间无显著差异。结论:阻断RAS可以改善高脂喂养大鼠的胰岛素抵抗和胰岛β细胞分泌功能,其机制可能为通过下调胰岛局部UCP2和上调GCLC的表达,减轻氧化应激损伤,从而保护胰岛β细胞功能。

糖痹康对糖尿病大鼠坐骨神经Ⅱ相代谢酶GCLc和GST pi蛋白与mRNA的影响

目的观察糖痹康对糖尿病大鼠坐骨神经II相代谢酶谷氨酸半胱氨酸连接酶亚基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit,GCLc)和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione s-transferase,GST)pi蛋白与mRNA的影响,探讨糖痹康对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经保护作用机制。方法雄性SD大鼠,高脂饲料与小剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)联合诱发糖尿病大鼠模型,模型成功后将糖尿病大鼠随机分为5组:模型组、α-硫辛酸(alpha lipoic acid,ALA)组(0.0268g/(kg·d),糖痹康高(2.5g/kg)、中(1.25g/kg)、低(0.625g/kg)剂量组,每组10只,另将雄性SD大鼠10只设为正常组。治疗12周后测大鼠右侧坐骨神经传导速度;Western blot检测大鼠坐骨神经中GCLc和GST pi蛋白的表达;实时荧光定量PCR检测大鼠坐骨神经中GCLc和GST pi mRNA的表达。结果与模型组相比,12周后ALA组、糖痹康高、中剂量组大鼠坐骨神经传导速度明显升高(P<0.05);ALA组、糖痹康高、中剂量组GCLc和GST pi蛋白及mRNA表达均明显高于模型组(P<0.05)。结论糖痹康可通过诱导Ⅱ相代谢酶GCLc和GST pi改善糖尿病大鼠坐骨神经损伤。

外周T细胞淋巴瘤组织中GCLC和GCLM的表达及其临床意义

目的:探讨外周T细胞淋巴瘤(PTCL)组织中谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM)的表达及其临床意义。方法:采用免疫组织化学法检测40例PTCL患者组织标本及20例淋巴结反应性增生组织中GCLC和GCLM的表达情况,分析其表达与PTCL患者临床病理特征的关系。结果:GCLC在PTCL组织中的阳性表达率为32.5%(13/40),在淋巴结反应性增生组织中未见明显表达,差异显著(P<0.05)。PTCL组织中GCLM的阳性表达率为35.0%(14/40),高于淋巴结反应性增生组织的10.0%,差异显著(P<0.05)。GCLC和GCLM的表达与PTCL患者的Ann-Arbor临床分期、B症状、国际预后指数(IPI)密切相关(P<0.05),但与患者的年龄、性别、乳酸脱氢酶(LDH)水平、骨髓侵犯均无关(P>0.05),且分期越晚(Ⅲ+Ⅳ期)、IPI(3~5分)越高者,GCLC和GCLM的阳性表达率越高。Spearman等级相关分析显示,PTCL组织中GCLC蛋白与GCLM蛋白的表达呈正相关。结论:GCLC和GCLM在PTCL组织中高表达,可能参与肿瘤的发生和发展,有望为PTCL的病因学研究及治疗提供理论依据。

转录因子DEC1和DEC2通过Ebox元件下调大鼠Gclc基因的表达

为研究Ebox元件在谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate-cysteine ligase catalyticsubunit,GCLC)基因表达中的地位,构建含Gclc上游5.9 kb调控序列,及突变Ebox(-3 853～-3 848)的萤火虫荧光素酶报道载体.转染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(L2),比较野生与突变报道载体的转录活性.共转染野生型载体与转录因子分化型胚胎软骨发育基因1/2(differentiated embryochondrocyte expressed gene1/2,DEC1/2)真核表达载体,检测DEC1/2对Gclc转录活性的影响;电泳迁移率(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)和超级迁移率实验(supershift assay)检测Ebox元件是否与DEC1/2特异结合.蛋白免疫印迹技术检测Dec1/2过表达对Gclc表达的影响.结果显示,载体构建符合预期;突变Ebox元件可显著上调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);共转染DEC1/2表达载体显著下调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);EMSA证实Ebox元件(-3 853～-3 848)与核蛋白结合,且特异性强;超级迁移率显示,结合的核蛋白有转录因子DEC1、DEC2;Western印迹结果显示,DEC1/2的表达明显下调Gclc的内源性表达.结果提示,转录因子DEC1与DEC2具有Gclc表达抑制活性,可能与Ebox(-3 853～-3 848)有关.

GCLC、GCLM在肿瘤中的作用研究进展概述

我国肿瘤发病率与死亡率居高,以乳腺癌、肺癌为代表的恶性肿瘤的诊治面临巨大挑战。氧化应激是指由于活性物质的产生或氧化还原系统代偿能力有限使得细胞内氧化还原状态被破坏的一种病理过程。研究表明氧化应激与肿瘤中氧化应激水平多处于失衡状态并与恶性肿瘤发生发展密切相关。谷胱甘肽(glutathione, GSH)在肺癌、结直肠癌等多种肿瘤中异常表达且与氧化应激失衡相关。另外参与合成GSH的关键酶谷氨酸半胱氨酸连接酶(glutamate cysteine ligase, GCL)及其亚基也受到很大关注,他们可能是造成恶性肿瘤中GSH合成紊乱及氧化应激失衡的重要原因,并在不同肿瘤中发挥促癌或抑癌的作用。但是GCL及其亚基与肿瘤发生发展的关系、与患者临床病理特征的关系尚未系统阐述,该文就GCL及其亚基在肿瘤中的表达及其意义进行综述。

雷公藤红素治疗变应性鼻炎大鼠的机制研究

目的:研究雷公藤红素对大鼠变应性鼻炎(AR)的治疗作用并初步探讨相关作用机制。方法:构建大鼠AR模型,测定大鼠第1天、第4天和第7天的行为学特征改变、鼻黏膜呼吸区组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的水平;测定鼻黏膜呼吸区组织核因子E2p45相关因子2(NRF2)的核内蛋白表达及谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的浆蛋白表达。结果:AR大鼠第1、4、7天的行为学特征改变显著(P<0.01),鼻黏膜呼吸区组织SOD、GSH、GSH-PX降低,MDA升高;NRF2的核内蛋白表达降低,GCLC的浆蛋白表达降低。雷公藤红素低剂量治疗组和高剂量治疗组能不同程度改善上述指标的变化,同时提高了鼻黏膜呼吸区组织NRF2的核蛋白表达和GCLC的浆蛋白表达。结论:雷公藤红素能改善AR大鼠的症状,其机制可能与提高鼻黏膜呼吸区组织NRF2的核蛋白表达和GCLC的浆蛋白表达相关。