上调GCLM改善缺氧复氧诱导的肾小管上皮细胞铁死亡

目的探讨谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基(glutamate-cysteine ligase modifier subunit,GCLM)减轻肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤(hypoxia reoxygenation,HR)的作用与机制。方法体外培养人近端小管上皮细胞(human proximal tubular epithelial cells,HK2),分为正常对照组(Ctrl组)、缺氧复氧组(HR组)以及GCLM过表达后的缺氧复氧组(HR+GCLM OE组),其中HR组在缺氧24 h(94%N_(2)+1%O_(2)+5%CO_(2),无血清无葡萄糖的DMEM/F12培养基)后复氧6 h(95%空气+5%CO_(2)),HR+GCLM OE组在转染了GCLM过表达质粒24 h后,再缺氧复氧处理。检测各组GCLM、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的表达水平,谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)等铁死亡相关指标并通过透射电镜观察线粒体形态。结果与对照组相比,HR组丙二醛以及活性氧蓄积(P<0.01),谷胱甘肽显著降低(P<0.01),透射电镜线粒体出现铁死亡改变,同时伴随着GCLM和GPX4表达下降(P<0.01)。与HR组相比,过表达GCLM能显著缓解活性氧以及丙二醛的蓄积(P<0.01),促进谷胱甘肽的生成以及GPX4的表达(P<0.01),缓解缺氧复氧介导的肾小管上皮细胞损伤。结论上调GCLM可能通过抑制铁死亡而改善缺氧复氧损伤,提示GCLM在急性肾损伤中有着潜在的治疗作用。

S-腺苷甲硫氨酸对Aβ抑制谷胱甘肽生成的影响

目的研究S-腺苷甲硫氨酸（SAM）对β-淀粉样肽（Aβ）抑制谷胱甘肽（GSH）生成的影响。方法培养人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）和人胶质瘤细胞系（U87）,分为对照组、SAM处理组、Aβ处理组、Aβ＋SAM组，用Western blot方法检测谷酰胺-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）、谷酰胺-半胱氨酸连接酶调节亚基（GCLM）和谷胱甘肽合成酶（GS）的蛋白表达量，实时定量PCR方法检测GCLC和GCLM mRNA表达量，用GSH试剂盒检测细胞GSH的含量。结果SH-SY5Y细胞和U87细胞经Aβ1-42处理后，GSH含量降低，合成过程中的催化酶GCLC、GCLM和GS的mRNA和相应蛋白表达量均下降，SAM干预后，GSH含量增加，GCLC、GCLM和GS的mRNA和相应蛋白表达量增高。结论SAM可通过增加GCLC、GCLM及GS的表达，提高GSH的含量，抑制Aβ诱导的氧化应激损伤，发挥保护作用。

外周T细胞淋巴瘤组织中GCLC和GCLM的表达及其临床意义

目的:探讨外周T细胞淋巴瘤(PTCL)组织中谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM)的表达及其临床意义。方法:采用免疫组织化学法检测40例PTCL患者组织标本及20例淋巴结反应性增生组织中GCLC和GCLM的表达情况,分析其表达与PTCL患者临床病理特征的关系。结果:GCLC在PTCL组织中的阳性表达率为32.5%(13/40),在淋巴结反应性增生组织中未见明显表达,差异显著(P<0.05)。PTCL组织中GCLM的阳性表达率为35.0%(14/40),高于淋巴结反应性增生组织的10.0%,差异显著(P<0.05)。GCLC和GCLM的表达与PTCL患者的Ann-Arbor临床分期、B症状、国际预后指数(IPI)密切相关(P<0.05),但与患者的年龄、性别、乳酸脱氢酶(LDH)水平、骨髓侵犯均无关(P>0.05),且分期越晚(Ⅲ+Ⅳ期)、IPI(3~5分)越高者,GCLC和GCLM的阳性表达率越高。Spearman等级相关分析显示,PTCL组织中GCLC蛋白与GCLM蛋白的表达呈正相关。结论:GCLC和GCLM在PTCL组织中高表达,可能参与肿瘤的发生和发展,有望为PTCL的病因学研究及治疗提供理论依据。

转录因子DEC1和DEC2通过Ebox元件下调大鼠Gclc基因的表达

为研究Ebox元件在谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate-cysteine ligase catalyticsubunit,GCLC)基因表达中的地位,构建含Gclc上游5.9 kb调控序列,及突变Ebox(-3 853～-3 848)的萤火虫荧光素酶报道载体.转染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(L2),比较野生与突变报道载体的转录活性.共转染野生型载体与转录因子分化型胚胎软骨发育基因1/2(differentiated embryochondrocyte expressed gene1/2,DEC1/2)真核表达载体,检测DEC1/2对Gclc转录活性的影响;电泳迁移率(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)和超级迁移率实验(supershift assay)检测Ebox元件是否与DEC1/2特异结合.蛋白免疫印迹技术检测Dec1/2过表达对Gclc表达的影响.结果显示,载体构建符合预期;突变Ebox元件可显著上调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);共转染DEC1/2表达载体显著下调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);EMSA证实Ebox元件(-3 853～-3 848)与核蛋白结合,且特异性强;超级迁移率显示,结合的核蛋白有转录因子DEC1、DEC2;Western印迹结果显示,DEC1/2的表达明显下调Gclc的内源性表达.结果提示,转录因子DEC1与DEC2具有Gclc表达抑制活性,可能与Ebox(-3 853～-3 848)有关.

灵芝多糖调控抗氧化因子表达抑制乳腺癌恶性表型研究

目的研究灵芝多糖对乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞凋亡的影响及作用机制。方法MCF-7和MDA-MB-231细胞分别给予灵芝多糖(25、50、75 mg/mL)干预后,MTS法检测灵芝多糖对乳腺癌细胞增殖的影响;TUNEL染色及流式细胞术探测灵芝多糖对乳腺癌细胞凋亡的影响;采用流式细胞术检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;检测细胞内谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平;采用q RT-PCR技术检测抗氧化相关基因谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基(glutamate-cysteine ligase regulatory subunit,GCLM)、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit,GCLC)、人硫氧还蛋白还原酶1(human thioredoxin reductase 1,TXNRD1)、苹果酸酶1(malic enzyme 1,ME1)、硫氧还蛋白(thioredoxin,TXN)m RNA表达;采用Western blotting检测GCLM、TXNRD1蛋白表达。结果给予灵芝多糖干预后,MCF-7、MDA-MB-231细胞活性明显降低(P<0.01),凋亡率显著升高(P<0.05、0.01),细胞内ROS水平显著升高(P<0.05、0.01),GSH水平明显下降(P<0.01);抗氧化因子m RNA及蛋白表达水平显著下调(P<0.05、0.01)。结论灵芝多糖能够通过抑制GCLM等抗氧化基因表达诱导ROS生成,促进乳腺癌细胞凋亡,进而抑制乳腺癌恶性进展。