多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的原核表达、纯化及酶活检测

目的:以人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)为研究对象,利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌(E.Coli)BL21中原核表达其编码序列,并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法:首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3,形成重组表达质粒pGEX-5X-3/T2。重组质粒转化大肠杆菌DH5α,测序鉴定后转化BL21,异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导后,表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白。对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖(G lutath ione-Sepharose)4B亲和层析柱进行纯化。然后根据ppGalNAc-T2的催化功能,设计底物,建立酶促反应体系,利用高效液相色谱(HPLC)进行酶活分析。结果:成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3/T2,通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达,利用亲和层析得到纯化的酶蛋白,并经W estern印迹得以验证。反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰。结论:成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3/T2,ppGalNAc-T2全长编码序列被成功表达、纯化及复性,检测到具有酶活性。

人NDRG1的GST融合表达、纯化及相互作用蛋白检测

目的:为了更好的了解NDRG1的功能,通过pulldown技术寻找与NDRG1相互作用的蛋白.方法:从已构建好的NDRG1pPROEXHTb重组载体中酶切下NDRG1cDNA,插入融合表达载体pGEX4T1,序列测定后,转化DH5α感受态细胞,在含氨苄青霉素的LB中高效表达.表达的GSTNDRG1经过谷胱甘肽琼脂糖4B亲和层析纯化,并与高表达细胞系HHCC孵育,通过SDSPAGE检测和NDRG1相互作用的蛋白.结果:纯化蛋白和HHCC孵育后,在Mr4.0×104处出现新增条带,应是与NDRG1相互作用的未知蛋白.结论:在肿瘤细胞HHCC中存在与NDRG1相互作用的蛋白.