豆壳过氧化物酶的分离纯化及其性质研究

从豆壳抽提液经硫酸铵分级沉淀，ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０离子交换层析，ＣｏｎＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲合层析和Ｂｉｏ－ＧｅｌＰ－６０凝胶过滤，纯化了豆壳过氧化物酶（ｓｏｙｂｅａｎｈｕｌｐｅｒ－ｏｘｉｄａｓｅ，ＳｈＰ）．纯化酶的比活力为７０７７Ｕ／ｍｇ，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上显示出一条蛋白质带．ＳｈＰ分子量为３８０００，等电点为３．９；ＳｈＰ为一含血红素的糖蛋白，含糖量为１８．７％，光谱学分析揭示，在４０６ｎｍ处有一典型的Ｓｏｒｅｔ带，在５１０ｎｍ和６４０ｎｍ处有特征吸收峰．酶反应的最适ｐＨ在４．０附近，最适温度为４５℃；在ｐＨ２．５～１２．０之间较稳定，７５℃，保温６０ｍｉｎ，酶活力残余６８％，ＳｈＰ是一种良好的耐酸碱、耐热过氧化物酶．动力学分析求得ＳｈＰ的表观Ｋｍ（愈创木酚）为１．６２ｍｍｏｌ／Ｌ，表现Ｋｍ（Ｈ２Ｏ２）为０．３４ｍｍｏｌ／Ｌ．在所测定的化学试剂中，Ｎ－３、ＣＮ－、Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋和Ｓｎ２＋对酶有较强烈的抑制作用，而重金属离子Ａｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋、Ｃｕ２＋。

豆壳过氧化物酶的盐酸胍变性与化学修饰研究

研究了盐酸胍对豆壳过氧化物酶(soybeanhullperoxidase,SHP,EC1.11.1.7)构象与活力的影响,发现去辅基SHP的盐酸胍变(复)性及荧光变化关系与SHP全酶分子的盐酸胍变(复)性及荧光变化关系明显不同。应用过碘酸氧化法去除SHP分子表面糖链,研究糖链去除对酶性质的影响,则证实了SHP分子表面的糖链去除导致酶热稳定性下降。应用不同的蛋白质侧链修饰剂对SHP进行化学修饰则表明,巯基、酪氨酸和色氨酸残基为酶活力非必需,而羧基、组氨酸和精氨酸残基为酶活力所必需。

豆壳过氧化物酶活力测定条件的优化

应用响应面法从过氧化氢、愈创木酚、温度、pH值、酶浓度等方面对过氧化物酶活力测定方法进行单因素分析,以优化豆壳过氧化物酶活力测定条件。结果表明,豆壳过氧化物酶在70℃、pH值为6.0,愈创木酚和过氧化氢加入量分别为25μL和21μL条件下测定的活力为最优值。

豆壳过氧化物酶的电子吸收光谱性质

应用电子吸收光谱技术研究了豆壳过氧化物酶 ( EC1 .1 1 .1 .7)的不同氧化态电子吸收光谱 ,并与其它来源的过氧化物酶作了比较研究 .天然态酶的特征吸收峰位为 40 4 nm的 Soret带 ,638nm的α带和 50 8nm的β带 ,与过氧化氢反应可生成三类复合物 .复合物 ( Com )在 40 8、580、61 8和 655nm处出现特征吸收 ;复合物 ( Com )在 41 9、52 9和 556nm处显示特征吸收 ;复合物 ( Com )则于 41 8、543和 578nm处显示特征吸收 .天然态酶经连二亚硫酸钠还原则出现 435和 558nm的特征峰 ,与氰化钾作用在 42 2和 544nm处显示特征吸收 .氰化钾对该酶的抑制为竞争性抑制 ,其 Ki 值为 2 .4μmol/L.

关于巯基和Mn^(2+)介导豆壳过氧化物酶氧化藜芦醇的研究

藜芦醇作为非酚型木素模型物具有较高的氧化还原电位,豆壳过氧化物酶(soybeanhullperoxidase,SHP,EC.1.11.1.7)通过依赖于过氧化氢的正常过氧化物酶催化循环不能氧化藜芦醇,但在还原型谷胱甘肽、Mn2+和有机酸络合剂存在下却可以通过不依赖于过氧化氢的氧化酶反应途径完成对藜芦醇的氧化,产物为藜芦醛,反应最适pH为4.2。动力学研究表明该反应遵循顺规序列反应机制;对藜芦醇的表观KM值为4.3mmol/L,对谷胱甘肽的表观KM值为4.8mmol/L。巯基还原剂二硫苏糖醇。

豆壳过氧化物酶的应用

过氧化物酶是一类重要的氧化还原酶，广泛存在于各种植物、动物和微生物体内。具有多种不同的生物学功能，可以催化过氧化氢氧化一系列的有机底物，在环境保护中用于氧化废水中的有机物，同时，过氧化物酶还可以用于医学检测中，特别是酶联免疫测定和电镜技术中。另外在生物传感器、木素降解、工业“三废”处理等方面都有应用。