兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin基因的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】旨在克隆兔豆状囊尾蚴(Cysticercus pisiformis)半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine protease inhibitor)Stefin基因(CpStefin),原核表达并纯化兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin蛋白,制备多克隆抗体并测定其效价。【方法】根据GenBank登录的猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin基因序列设计引物,以提取的兔豆状囊尾蚴总RNA为模板,运用RT-PCR方法克隆兔豆状囊尾蚴Stefin基因,构建克隆载体pMD-19TCpStefin,分析Cpstefin蛋白氨基酸序列的二级结构、理化性质、结构域,并分析其与其它绦虫Stefin基因的亲缘关系,构建系统进化树。以克隆载体pMD-19T-CpStefin为模板扩增兔豆状囊尾蚴Stefin基因,回收纯化的扩增产物连接到原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-CpStefin,双酶切、测序结果与预期结果一致。重组质粒pGEX-4T-CpStefin转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达获得重组蛋白。应用亲和层析法纯化可溶性CpStefin重组蛋白,进行SDS-PAGE鉴定。重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,运用ELISA方法测定其效价。【结果】首次克隆兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin基因,基因大小约为290 bp,成功构建克隆载体pMD-19T-CpStefin;菌液PCR和双酶切鉴定结果表明重组质粒pGEX-4T-CpStefin构建正确,通过IPTG诱导表达获得分子质量大小约为35 kU的可溶性融合蛋白,亲和层析法纯化获得纯度较高的CpStefin重组蛋白,制备出的多克隆抗体效价达到1∶25600。【结论】本研究首次克隆出豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin基因,运用原核表达系统可溶性表达豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin蛋白,纯化获得纯度较高的豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin重组蛋白,制备的多克隆抗体效价达到1∶25600。

有钩与无钩豆状囊尾蚴头节超微形态的比较

旨在比较观察有钩和无钩豆状囊尾蚴的头节在相对静止和相对运动时的超微结构变化。在屠宰检验和病理剖检过程中采取发育良好的豆状囊尾蚴,直接剪破囊泡从中取出豆状囊尾蚴;或用含10%兔胆汁生理盐水培养,使囊尾蚴从囊泡中翻出,制作样品,用扫描电镜观察和记录。结果显示:有钩和无钩豆状囊尾蚴在不同状态下的超微结构差异主要出现在顶突。有钩豆状囊尾蚴在相对静止时顶突的前端比较钝,通过皮肌柱与鹿角样的小钩相连。在轻度运动时皮肌柱收缩,小钩向外伸展,顶突前端变扁平。皮肌柱持续收缩时,顶突前端开始内陷,小钩向外斜上方伸展,形成喇叭口样结构。当顶突强烈收缩时,皮肌柱陷入顶突内形成圆筒,小钩沿圆筒口排列形成菊花样结构。无钩豆状囊尾蚴在相对静止时,其顶突扁平,如同数层圆饼叠放在一起,中央有一个圆形结节,周缘有齿轮状花纹。当顶突轻度运动时,中央部的结节内陷,出现瓣状结构,顶突周边形成半圆形环状结构,如同一个救生圈。强烈运动时,结节的瓣状结构打开,如同一个喇叭口。顶突周围的皮层向外张开,恰似轮胎样结构。在顶突的喇叭口与轮胎样结构之间有数条放射状皱襞。顶突变成一个车轮样结构。有钩和无钩豆状囊尾蚴的吸盘均位于顶突之后,可出现三种收缩纹,即环形收缩、纵形收缩和放射状收缩。有钩和无钩豆状囊尾蚴顶突的超微结构完全不同,在不同的运动状态中可出现各自特殊的结构变化。

一种新型无钩豆状囊尾蚴的鉴定和18S DNA序列分析

旨在鉴别无钩豆状囊尾蚴与有钩豆状囊尾蚴的区别。用扫描电镜对自然感染的豆状囊尾蚴头节进行超微结构观察,对其18S DNA进行PCR扩增和序列分析,并与其他动物的囊尾蚴作了进化树比较。结果显示:超微结构观察无钩和有钩豆状囊尾蚴的主要区别位于顶突,而吸盘和原始体节的结构是相同的。从囊泡中取出的豆状囊尾蚴多处于相对静止状态。无钩豆状囊尾蚴的顶突如同数层圆饼叠放在一起,表面比较平坦,中央有一个较大的结节,结节的直径约为20μm,周边有数层齿轮状花纹,形成重合式齿轮状构造。有钩豆状囊尾蚴顶突的前端比较钝,通过皮肌柱与形似鸡爪样的小钩相连。小钩表面光滑,富有光泽,具有坚硬的外观,长120~150μm。通过用18S-P1和18S-P2引物对无钩和有钩豆状囊尾蚴的目的基因、感受态细胞的培养液和菌体质粒的PCR检测,均获得相同的目的基因条带。测序结果表明18S-P1引物扩增的无钩豆状囊尾蚴与有钩豆状囊尾蚴750 bp序列的差别比18S-P2引物扩增的666 bp序列的区别明显。与其他动物囊尾蚴相关序列的进化比较显示,无钩豆状囊尾蚴与牛囊尾蚴有亲缘性,而有钩豆状囊尾蚴则与猪囊尾蚴有亲缘关系。总之,无钩和有钩豆状囊尾蚴虽然同属豆状囊尾蚴,但无钩豆状囊尾蚴是一种新发现的豆状囊尾蚴。

兔豆状囊尾蚴和豆状带绦虫头节的组织结构观察

采集兔豆状囊尾蚴并感染犬，收集成熟豆状带绦虫头节，将新鲜豆状囊尾蚴和胆汁法翻出头节的豆状囊尾蚴以及豆状带绦虫头节用多聚甲醛固定，石蜡切片，HE染色，光镜下观察了成熟豆状囊尾蚴和豆状带绦虫头节的组织结构。结果表明，豆状囊尾蚴和豆状带绦虫均有4个吸盘，37个小钩分内、外两圈排列在顶突上。豆状囊尾蚴有2个囊腔，较小的囊腔包括头节和颈部，较大的囊腔包括囊壁和囊液；豆状囊尾蚴的小钩有芯髓，豆状带绦虫的小钩无芯髓，小钩横切直径为0．79～1．32μm，芯髓直径为0．053～0．106μm；翻出头节的豆状囊尾蚴可明显地分为头节、颈部和囊泡3个部分，其中颈部有用以形成节片的棘。证明豆状囊尾蚴有较健全的排泄系统，其囊壁结构和一般绦虫蚴相同，豆状囊尾蚴2个囊腔的组成也和猪囊尾蚴相同。

豆状囊尾蚴人工感染家兔抗体水平的消长

取人工感染豆状带绦虫犬自然排出的孕卵节片,虫卵计数后以不同数量感染家兔,定期采血,待囊尾蚴成熟后扑杀,计数。同时,用豆状囊尾蚴粗制抗原所建立的ELISA诊断方法,检测家兔的抗体变化情况。结果显示,家兔在感染后第3周血清抗体呈阳性,且抗体水平逐步上升,第8周达到最高水平,直至第10周扑杀时仍呈较高的阳性水平。抗体水平随感染数量的增加而升高,虫体负荷随感染强度的增加而逐步升高,感染虫体数量的多少对抗体出现的时间影响不大。研究结果为该病的流行病学调查及免疫预防奠定了基础。

豆状囊尾蚴的超微结构观察

本研究旨在观察豆状囊尾蚴在不同状态下的超微结构。从肉联厂屠宰检验采取豆状囊尾蚴,直接剪破囊泡从中取出豆状囊尾蚴;或用含10%胆汁生理盐水培养囊尾蚴,待其从囊泡中翻出后,用扫描电镜观察和记录。位于囊泡内的头节,从其顶端观察,顶突呈伞状,皮肌柱连接小钩覆盖于头节的前端。从侧面观察,一排有鹿角样的小钩附着于顶突。4个吸盘呈洞穴状位于顶突之后分布在头节的四周。原始颈节较宽,体节较细,表面均有许多皱褶。培养后的豆状囊尾蚴可明显区分为头节、颈节、体节和囊泡区,顶突上的皮肌柱收缩,鹿角样的小钩向周围伸展,吸盘也发生环形和纵形收缩,颈节的环状收缩和体节的纵行收缩均明显可辨。豆状囊尾蚴处于不同状态时,其超微结构明显不同。

屠宰兔感染豆状囊尾蚴的体内分布及卫生评价

对患豆状囊尾蚴病兔的胴体及内脏进行了详细的检验,并提出了卫生评价。结果表明,豆状囊尾蚴主要侵害的靶组织是大网膜,其次是直肠浆膜和肠系膜;而肝脏则不是其侵害的主要靶器官,只有在病情严重的情况下,肝脏才发现病变。胴体及其他胸、腹腔脏器中没有检出病变。另外,在检验的过程中发现在一个包囊中有2个~4个囊泡的豆状囊尾蚴。据此作者认为,对病兔的肝脏进行仔细检查后,在没有病变的情况下可以食用,而胃肠道的组织由于是豆状囊尾蚴侵害的主要靶器官,所以不得食用,须进行无害化处理。

兔豆状囊尾蚴的压片技术及染色方法研究

为了详细观察豆状囊尾蚴头节的形态结构,通过屠宰检验或病兔剖检采集的豆状囊尾蚴的囊泡,制作压片后用不同的染色方法进行了比较。结果表明,制作豆状囊尾蚴头节压片的关键是载玻片要洁净、干燥,从囊泡中取出的头节应完整无损,并尽量除去黏附在头节上的囊液。将带有头节的结节放在载玻片的中部,再在其上放一载玻片,两手在载玻片的两端均匀用力挤压,待结节全部展开即可。为了观察头节的正面结构,在压制玻片前,应用手术刀片除去原始颈节与体节部分。通过常用的几种单染色和复染色法对压片进行染色,证明单染色更有利于详细的观察头节的结构,而且几种单染色之间有互补染色效果。

家兔豆状囊尾蚴病的组织病理学研究

为研究家兔豆状囊尾蚴病的病理学变化，从33只自然感染病例采取肝脏、心脏、肾脏与肺脏组织块，经甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡切片，切片厚度5～6μm，HE染色，光镜观察。结果表明，肝脏发生由豆状带绦虫六钩蚴穿行所致的出血坏死区以及在此基础上形成的上皮细胞、巨细胞肉芽肿。这种特异性病变可作为该病病理诊断的重要指征之一。同时也发现间质性肝炎、肾炎、肺炎及心肌纤维萎缩等变化。本研究为阐明该病的肝脏特征性病理变化及进一步探讨其发生机制奠定了基础。

兔豆状囊尾蚴的体外培养研究

为了观察兔豆状囊尾蚴的体外发育情况及头节的详细结构,用不同浓度的猪胆汁和兔胆汁对兔豆状尾蚴进行培养,并对培养后的形态进行了观察。结果表明,在不同浓度和不同来源的胆汁、生理盐水中,豆状囊尾蚴的头节翻出率、存活时间各不相同,最快3 min,且随时间延长,翻出率越高。其中以兔胆汁的效果较好。在不同浓度兔胆汁中培养20 min头节翻出率均为100%,而在不同浓度猪胆汁中培养20 min头节翻出率分别为83%、67%、67%、50%、33%。培养后的豆状囊尾蚴在体外存活时间最长可达36 h。翻出头节的囊尾蚴可清晰看到头节、颈节、原始体节和囊泡四部分。

豆状囊尾蚴与细颈囊尾蚴和宿主(兔)的同工酶、蛋白质比较研究

用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离出豆状囊尾蚴囊液乳酸脱氢酶同工酶4～5条酶带,酯酶同工酶1条酶带,蛋白质6～9条区带;豆状囊尾蚴囊壁和头节乳酸脱氢酶同工酶3～4条酶带,酯酶同工酶无,蛋白质17条区带;细颈囊尾蚴囊液乳酸脱氢酶同工酶1～4条酶带,酯酶同工酶1～3条酶带,蛋白质7～10条区带;宿主——兔腹水乳酸脱氢酶同工酶5条酶带,酯酶同工酶3～5条酶带,蛋白质13～16条区带。并作了豆状囊尾蚴与细颈囊尾蚴囊液同工酶、蛋白质和豆状囊尾蚴与宿主的同工酶、蛋白质相互关系的详细分析,结果表明豆状囊尾蚴与细颈囊尾蚴的同工酶和蛋白质具有差异和两者可能存在交叉免疫;豆状囊尾蚴的酶蛋白和蛋白质来源独立于宿主,但在一定程度上受宿主的影响。

家兔豆状囊尾蚴病的流行现状及防治措施

叙述了家兔豆状囊尾蚴病的流行现状及防治措施。

兔豆状囊尾蚴病研究进展

豆状囊尾蚴是豆状带绦虫的中绦期幼虫,主要感染家兔等兔形目动物。豆状囊尾蚴病是家兔寄生虫病中较普遍和较严重的一种,由于无明显的临床症状,未能引起养殖户的足够重视,因而临床用药不规范,治疗效果欠佳,严重影响了中国养兔业的发展。因此,作者综述了兔豆状囊尾蚴病的病原形态、分子生物学、流行病学、致病性、诊断与免疫预防等方面的研究进展,为兔豆状囊尾蚴病的防控及相关研究提供参考。

兔豆状囊尾蚴Tp14基因的克隆及其序列分析

为鉴定兔豆状囊尾蚴(C.pisiformis)合适的诊断或免疫用抗原,本研究根据带科其他种属绦虫14ku基因的保守区设计引物,利用RT-PCR从C.pisiformis总RNA中成功扩增出长度为261bp的基因片段,命名为Tp14,预测其编码87个氨基酸。对其核苷酸同源性分析表明,该基因序列与泡状带绦虫、细粒棘球蚴、猪带绦虫基因序列的相似性均大于85%,处于同一进化分支上,表明该基因具有种属特异性;同时通过生物信息学软件对其蛋白二级结构、疏水性及抗原表位等方面的预测,认为其有望成为诊断或免疫用抗原。

兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶基因的表达及免疫保护性分析

为探讨豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶的免疫保护性能,在毕赤酵母中表达半胱氨酸蛋白酶基因,表达产物经分子筛纯化后免疫试验家兔,3免之后进行人工攻虫保护试验,且以豆状囊尾蚴烯醇酶为对照进行同步免疫和攻虫试验。结果显示,成功表达了半胱氨酸蛋白酶蛋白,且该蛋白能够识别兔豆状囊尾蚴病阳性血清;半胱氨酸蛋白酶蛋白和豆状囊尾蚴烯醇酶抑虫效果均较差。结果表明,酶蛋白在免疫保护方面的功能比较弱,不适于做疫苗的候选抗原。