豆类丝核菌次级代谢产物的抑瘤作用及其对荷瘤小鼠巨噬细胞活性的影响

建立种植性肝癌(H22)实体瘤动物模型,并给荷瘤小鼠灌服含有苦马豆素(swainsonine,SW)且剂量分别为2.7和16.2mg/(kg·d)的豆类丝核菌次级代谢产物稀释液,分别于灌药前(0d)及灌药后4d和8d时测定其肿瘤抑制率和腹腔巨噬细胞吞噬百分率。结果表明,8d时 组(高剂量灌药组)的腹腔巨噬细胞吞噬率达到(33.99±1.56)%,显著高于 组(生理盐水对照组)的(27.95±4.03)%; (低剂量灌药组)、 2组肿瘤抑制率分别在4d时达到26.44%和33.91%,8d时达到46.98%和47.22%。说明该次级代谢产物能够使荷瘤动物巨噬细胞吞噬力增强,并能抑制种植性实体瘤(H22)的生长。表明该次级代谢产物具有抗肿瘤药用价值。

豆类丝核菌发酵代谢产物中苦马豆素的测定

利用气相色谱法,对实验室分离保存的6株豆类丝核菌发酵代谢产物中的苦马豆素(swainsonine,SW)进行了定性、定量分析。结果表明,豆类丝核菌发酵代谢产物中含有大量SW,其中02-6B与02-3A2株菌代谢产物中苦马豆素含量分别达到1093.17与1199.64mg/L,说明这2株菌可用于SW生物合成的研究,并有利于降低SW生物合成的成本。

豆类丝核菌次级代谢产物抗肿瘤作用的病理学观察

通过建立种植性肝癌(H22)实体瘤动物模型,并给荷瘤小鼠灌胃含有苦马豆素(swainsonine,SW)且剂量分别为2.7mg·kg-1·d-1和16.2mg·kg-1·d-1的豆类丝核菌次级代谢产物稀释液,分别于灌药后8d、16d剖检荷瘤动物并取肿瘤组织与肝组织制做石蜡切片,HE染色,普通光镜观察。结果表明,该次级代谢产物能抑制种植性实体瘤(H22)的生长和转移。因此,该次级代谢产物具有抗肿瘤药用价值。

豆类丝核菌中生物碱的提取及苦马豆素含量测定

将豆类丝核菌菌株 7-1、7-3接种于改良 Czapek′s培养基 ,置 2 5～ 2 7℃培养箱培养 1 4d。收集菌丝体 ,自然干燥后乙醇索氏提取 ,回收乙醇至糖浆状 ,H2 O∶ CH2 Cl2 (3∶ 1 ,v/v)萃取 ,水层调 p H1 0后 ,再用 H2 O∶CH2 Cl2 (3∶ 1 ,v/v)萃取 ,水层调 p H7,浓缩后上 73 2型强酸性阳离子交换树脂 ,用 1 mol/LNH4 OH洗脱 ,收集氨洗液 ,调 p H7,浓缩后冻干 ,得到一种浅黄色粉末。取苦马豆素标准品 1 0 0 μg及浅黄色粉末提取物 1 0mg,分别用 1 ml吡啶溶解 ,取 0 .1 ml加 BSTFA0 .1 ml,5 0℃水浴 3 0 min。取反应液 1 μl,直接进样作 GC。结果表明 ,在相同的气相色谱条件下 ,在相同出峰时间 (1 .2～ 8min)内 ,标准品的峰形与总生物碱的峰形完全一致 ,可以判定生物碱中含有苦马豆素。根据计算得出菌株 7-1、7-3生物碱中苦马豆素含量为 5 .90 3 mg/g和 7.0 0 6mg/g。

豆类丝核菌次级代谢产物对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

目的:研究豆类丝核菌次级代谢产物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能的影响。方法:采用腹腔注射环磷酰胺(80mg/kg)制备免疫抑制模型,并给模型小鼠灌胃分别含苦马豆素(Swainsonine,SW)8、16、32mg/(kg.d)的豆类丝核菌次级代谢产物稀释液11天,同时设正常对照组和免疫抑制模型组,末次灌胃后24小时,眼眶采血,收集胸腺和脾,进行免疫学检测。结果:腹腔注射CTX80mg/kg,连续3天,可致小鼠免疫抑制,剂量为8、16mg/(kg.d)的SW组均可提高小鼠的外周血白细胞数,颉颃环磷酰胺所致的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的降低,提高外周血中溶血素水平、脾脏淋巴细胞转化以及NK细胞杀伤活性,尤其以SW16mg/(kg.d)最为明显。结论:豆类丝核菌次级代谢产物对环磷酰胺致免疫抑制小鼠的免疫功能有一定的恢复和增强作用。

豆类丝核菌次级代谢产物的急性毒性与致突变性试验

通过经口急性毒性试验、小鼠骨髓微核试验和精子畸形试验对豆类丝核菌次级代谢产物的急性毒性和致突变性进行了研究.结果表明,以该代谢产物中苦马豆素的量计算,小鼠经口急性毒性试验的LD50为226.46mg/kg,LD50的95%可信限为158.49～323.59mg/kg,是治疗肿瘤剂量的14～84倍,属于实际低毒级药物.微核试验和精子畸形试验的各试验组与阴性对照组比较差异均不显著(P＞0.05),说明豆类丝核菌次级代谢产物无明显致突变性;各试验组之间比较差异均不显著(P＞0.05),说明微核的形成和精子畸形的形成与受试物无量效关系.结论:豆类丝核菌次级代谢产物是一种较安全的抗肿瘤药物.

豆类丝核菌次级代谢产物对荷瘤小鼠T淋巴细胞活性的影响

目的:研究豆类丝核菌次级代谢产物对荷瘤动物的免疫调节作用。方法:通过给荷瘤小鼠灌注含有苦马豆素(swainsonine,SW)且剂量分别为2.7 mg·kg-1·d-1和16.2 mg·kg-1·d-1的豆类丝核菌次级代谢产物稀释液,分别于灌药前(0d)及灌药后4 d、8 d、12 d、16 d测定荷瘤鼠T淋巴细胞活化指数。结果:该次级代谢产物能够使荷瘤动物T淋巴细胞活性增强,其中含SW 16.2 mg·kg-1·d-1剂量标准的次级代谢产物对荷瘤动物的免疫刺激作用明显。因此,该次级代谢产物具有抗肿瘤免疫刺激作用。

豆类丝核菌次级代谢产物对阿霉素所致小鼠骨髓和心肌毒性的保护作用研究

探讨了豆类丝核菌次级代谢产物对阿霉素(ADR)所致小鼠骨髓抑制及心肌损伤的保护作用。建立小白鼠骨髓抑制和心肌损伤模型。检测血常规,描记心电图,测定血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性,心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。心肌组织石蜡切片,HE染色,光镜观察。结果表明阿霉素4 mg.kg-1可致小白鼠骨髓抑制和心肌损伤。豆类丝核菌次级代谢产物可抑制阿霉素引起的白细胞数、红细胞数、血红蛋白量的减少;使心率加快,心电图Q波振幅减小,QRS波时间缩短和S-T段回升;降低血清CK、LDH活力,增强心肌SOD活力,降低MDA含量,减轻心肌组织损伤。豆类丝核菌次级代谢产物对ADR所致小白鼠骨髓和心肌毒性有一定的保护作用。

豆类丝核菌中苦马豆素的提取

采用Ｈ２Ｏ∶ＣＨ２Ｃｌ２萃取、７３２型阳离子树脂交换等方法，从豆类丝核菌中分离到纯结晶，经薄板层析法发现，豆类丝核菌提取物浓缩的粗品液和苦马豆素标准品经Ｅｈｒｌｉｃｈ＇ｓ试剂显色后，二者均出现一椭圆形紫色斑点，且Ｒｆ值均为０．８１；气相色谱法研究发现，提取物纯品标样（１５．９４２０ｍｇ／Ｌ）与苦马豆素标准品在同一色谱条件下显示出完全一致的峰形，证明从豆类丝核菌中分离到的纯结晶是苦马豆素纯品。研究还表明豆类丝核菌干燥菌丝体中苦马豆素含量达１．２３％～２．９９％．

豆类丝核菌次级代谢产物对小白鼠胎儿的致畸作用

将妊娠的雌鼠随机分为5组,分别灌胃给予生理盐水、10 mg/kg环磷酰铵(CP)及高、中、低剂量豆类丝核菌次级代谢产物(苦马豆素含量分别为56.62、14.15、3.54 mg/kg),临产前剖腹取出胎鼠,将1/2胎鼠用茜素红染色做骨骼畸形观察,另1/2胎鼠用Bouins染色做内脏畸形检查,研究豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠胎儿的致畸作用。结果显示,3个剂量组孕鼠增重、外观畸形率、骨骼畸形率、内脏畸形率与空白对照组均差异不显著(P>0.05),而与CP阳性对照组均差异极显著(P<0.01)。表明,在此剂量和条件下,豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠无明显母体毒性,对胎鼠无发育毒性和致畸作用。

豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠行为致畸学研究

研究了豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠后代的行为致畸作用。将5组孕鼠分为空白对照组、豆类丝核菌次级代谢产物低剂量组、中剂量组、高剂量组及阳性对照组,分别灌胃给予生理盐水、低剂量(SW含量3.54 mg/kg)、中剂量(SW含量14.15 mg/kg)、高剂量(SW含量56.62 mg/kg)豆类丝核菌次级代谢产物及10 mg/kg环磷酰铵(CP),待其自然分娩后,观察其后代生长发育及行为状态。结果表明,豆类丝核菌次级代谢产物3个剂量组在反射能力、协调运动能力、学习记忆能力及自主活动能力各方面指标与空白对照组相比差异均不显著(P>0.05),而与阳性对照组相比差异极显著(P<0.01)。在本实验的剂量和条件下,豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠后代不具有行为致畸作用。

豆类丝核菌次级代谢产物对化疗骨髓抑制小鼠的保护作用

【目的】探讨豆类丝核菌次级代谢产物对环磷酰胺所致小鼠骨髓抑制的保护作用及其作用机制。【方法】将昆明种小白鼠60只均分为6组:Ⅰ组(正常对照组)、Ⅱ组(CTX模型对照组)、Ⅲ组(苦马豆素(SW)低剂量组)、Ⅳ组(SW中剂量组)、Ⅴ组(SW高剂量组)、Ⅵ组(SW16 mg/kg)。Ⅰ、Ⅱ组灌胃生理盐水,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组分别灌胃浓度为8,16,32,16 mg/kg的SW液,剂量皆为0.4 mL/d,共10次;末次灌胃6 h后,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组腹腔注射环磷酰胺(CTX)80 mg/kg,每天1次,连续3 d,末次注射后24 h,眼眶采血并处死小鼠,测定血常规、脾脏指数、脾集落形成单位(CFU-S)、骨髓有核细胞(BMC)数及骨髓细胞增殖试验,研究豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠骨髓造血功能的影响。【结果】腹腔注射CTX80 mg/kg连续3次,可致小鼠骨髓抑制。豆类丝核菌次级代谢产物(SW剂量为16mg/kg)可较好抑制CTX引起的白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白含量(HgB)、骨髓有核细胞数(BMC)减少;各剂量的SW能明显增加CFU-S数,其中以SW16 mg/kg效果最佳。当SW为8 mg/kg时,能很好地刺激骨髓细胞增殖。【结论】豆类丝核菌次级代谢产物对环磷酰胺所致小鼠骨髓抑制有较好的保护作用,其机制可能是通过刺激骨髓细胞增殖,增加BMC数和髓外造血来实现。

豆类丝核菌次级代谢产物对动植物细胞损害作用的对比

目的探索豆类丝核菌或其次级代谢产物的动植物损害在细胞生物学上的作用,为苦马豆素(swainsonine,SW)的毒理学研究提供新的思路。方法通过制作豆类丝核菌次级代谢产物污染的饲料和人工污染豆类丝核菌饲料,饲喂家兔17d,剖检家兔并取其脑、肝脏、肾脏等组织分别进行病理组织学和电镜观察;并将不同浓度的次级代谢产物和不同株的豆类丝核菌分别污染回接的绿豆,待84h培养后,进行组织学和电镜观察。结果在对动植物细胞损害作用中,豆类丝核菌次级代谢产物使家兔脑组织和淋巴细胞呈现空泡变性,神经细胞核糖体脱颗粒,粗面内质网扩张等变化;同时还能使植物根部组织结构受损,细胞呈现空泡变性,内膜破裂等变化。结论豆类丝核菌引起的动物中毒作用主要是其次级代谢产物中SW发挥毒性,且同疯草中毒引起的病理变化基本一致;菌株对植物根部的致病性与其次级代谢产物中SW含量呈正相关。即推测,SW很有可能不仅是动物豆类丝核菌中毒的主要毒素,而且是豆科植物丝核菌病中细胞损害的主要化学物质。

雷氏盐沉淀法对豆类丝核菌菌丝体中有机物的分离提取

采用雷氏盐沉淀法对豆类丝核菌菌丝体中有机物进行了分离提取。经熔点测定仪及GC-MS初步鉴定得到5种物质,蒲公英甾醇、α-香树脂醇、大狼毒素以及两种未知化合物,均是首次从豆类丝核菌菌丝体中得到。

豆类丝核菌次级代谢产物对肿瘤细胞超微结构的影响

通过建立种植性肝癌(H22)实体瘤动物模型,并给荷瘤小鼠灌胃含有苦马豆素(swainsonine,SW)且剂量分别为2.7mg/(kg·d)和16.2mg/(kg·d)的豆类丝核菌次级代谢产物稀释液,于灌药后16d剖检荷瘤动物并取肿瘤组织与肝组织制作超薄切片,透射电镜观察。结果表明,该次级代谢产物能抑制种植性实体瘤(H22)的生长和转移。因此,该次级代谢产物具有抗肿瘤药用价值。

豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠的一般生殖毒性

研究豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠的一般生殖毒性。昆明种小鼠80只,随机分为4组,每组20只,雌雄各半。设一个空白对照组和3个试验组,给药剂量分别为56.62、14.15和3.54 mg/kg。交配前雄鼠连续给药28 d,雌鼠连续给药14 d,雌雄按1∶1合笼交配,发现阴道栓之日定为受孕始日,交配后雌鼠继续给药13 d。结果表明,56.62 mg/kg对雄鼠、雌鼠、仔鼠均有影响,表现为雄鼠附睾质量(P<0.01)、附睾系数(P<0.05)、精子总数(P<0.01)的异常;雌鼠体质量的下降(P<0.05)以及仔鼠第4天成活率的降低(P<0.05)。14.15 mg/kg使雄鼠附睾质量(P<0.01)和附睾系数(P<0.05)降低并造成精子总数增多(P<0.05)。3.54 mg/kg对所有指标无显著影响(P>0.05)。因此,在本试验条件下,小鼠一般生殖毒性无作用剂量为3.54 mg/kg,相当于肿瘤有效治疗量的1.31倍。

豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠围产期毒性的研究

[目的]为豆类丝核菌次级代谢产物在临床上的安全用药提供试验依据。[方法]将受孕0 d的母鼠随机分为正常对照组,豆类丝核菌次级代谢产物56.62、14.15、3.54 mg/kg 4个组,研究豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠的围产期毒性。[结果]中剂量组母鼠21 d体重显著下降(P<0.05)。各试验组F1代小鼠出生胎数、0 d成活率与对照组无显著差异(P>0.05),而生长指数、内脏指数、游泳生存时间、生理发育指标、反射发育指标与对照组有显著或极显著差异。[结论]在该试验条件下豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠有围产期毒性,在临床上作为抗肿瘤药物使用时孕妇应禁用。

红花三叶草中产苦马豆素豆类丝核菌的分离与鉴定

为了确认中国红花三叶草中是否存在产苦马豆素(SW)的豆类丝核菌,用改良的真菌分离方法从植物样品中分离豆类丝核菌。根据豆类丝核菌的形态特征对分离的真菌进行初步筛选,然后对初步筛选所得真菌的5.8SrDNA-ITS序列进行扩增、测序并构建系统发育树以确定初步筛选真菌的种属,经薄层色谱和气相色谱对豆类丝核菌菌丝体提取物进行SW检测。最终,筛选出一株符合豆类丝核菌形态特征的丝核菌属真菌RL2012,薄层色谱和气相色谱检测到其菌丝体提取物中含有SW。综上分析最终确认红花三叶草中存在产苦马豆素的豆类丝核菌。

豆类丝核菌次级代谢产物对鸡免疫功能的影响

研究豆类丝核菌次级代谢产物对鸡免疫功能的影响。试验一将200只14日龄健康未免疫雏公鸡随机分为8组,Ⅰ-Ⅳ组动物于14日龄以新城疫活疫苗滴鼻进行第1次免疫,2周后加强免疫1次,Ⅴ-Ⅷ组不免疫。Ⅰ-Ⅲ组、Ⅴ-Ⅶ组为试验组,分别注射高、中、低(1、2、4 mg/kg)3种剂量的豆类丝核菌次级代谢产物。Ⅳ组和Ⅷ组分别为疫苗对照组和空白对照组。于首免后连续6周各组随机抽取10只鸡进行ND-HI抗体效价检测;于首免后连续5周测外周血中白细胞数;于3、5、7周龄检测免疫器官(胸腺,脾脏,法氏囊)指数。试验二将20只30日龄健康已免疫雏公鸡随机分为4组用MTT法检测脾脏淋巴细胞的增殖活化。中剂量免疫试验组各试验指标与疫苗对照组相比均显著提高,中剂量未免疫试验组各试验指标与空白对照组相比均显著提高,高、低剂量试验组与疫苗对照组相比各试验指标无显著差异。

豆类丝核菌次级代谢产物的遗传毒性与致突变作用

通过小鼠骨髓染色体畸变试验、睾丸染色体畸变试验及鼠伤寒沙门氏菌回复试验考察豆类丝核菌次级代谢产物的遗传毒性与致突变性。结果显示,豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠骨髓染色体及睾丸染色体均无致畸变作用;Ames试验结果显示在本次试验的各个浓度下无论是加入活化系统(S-9混合液)还是不加,回变菌落数均未大于自然回变菌落的2倍,而各阳性对照组均显示强烈的诱变作用,表明,本次试验剂量和条件下,豆类丝核菌次级代谢产物未见遗传毒性和致突变作用。