豆类丝核菌次级代谢产物的抑瘤作用及其对荷瘤小鼠巨噬细胞活性的影响

建立种植性肝癌(H22)实体瘤动物模型,并给荷瘤小鼠灌服含有苦马豆素(swainsonine,SW)且剂量分别为2.7和16.2mg/(kg·d)的豆类丝核菌次级代谢产物稀释液,分别于灌药前(0d)及灌药后4d和8d时测定其肿瘤抑制率和腹腔巨噬细胞吞噬百分率。结果表明,8d时 组(高剂量灌药组)的腹腔巨噬细胞吞噬率达到(33.99±1.56)%,显著高于 组(生理盐水对照组)的(27.95±4.03)%; (低剂量灌药组)、 2组肿瘤抑制率分别在4d时达到26.44%和33.91%,8d时达到46.98%和47.22%。说明该次级代谢产物能够使荷瘤动物巨噬细胞吞噬力增强,并能抑制种植性实体瘤(H22)的生长。表明该次级代谢产物具有抗肿瘤药用价值。

豆类丝核菌次级代谢产物抗肿瘤作用的病理学观察

通过建立种植性肝癌(H22)实体瘤动物模型,并给荷瘤小鼠灌胃含有苦马豆素(swainsonine,SW)且剂量分别为2.7mg·kg-1·d-1和16.2mg·kg-1·d-1的豆类丝核菌次级代谢产物稀释液,分别于灌药后8d、16d剖检荷瘤动物并取肿瘤组织与肝组织制做石蜡切片,HE染色,普通光镜观察。结果表明,该次级代谢产物能抑制种植性实体瘤(H22)的生长和转移。因此,该次级代谢产物具有抗肿瘤药用价值。

豆类丝核菌次级代谢产物对荷瘤小鼠T淋巴细胞活性的影响

目的:研究豆类丝核菌次级代谢产物对荷瘤动物的免疫调节作用。方法:通过给荷瘤小鼠灌注含有苦马豆素(swainsonine,SW)且剂量分别为2.7 mg·kg-1·d-1和16.2 mg·kg-1·d-1的豆类丝核菌次级代谢产物稀释液,分别于灌药前(0d)及灌药后4 d、8 d、12 d、16 d测定荷瘤鼠T淋巴细胞活化指数。结果:该次级代谢产物能够使荷瘤动物T淋巴细胞活性增强,其中含SW 16.2 mg·kg-1·d-1剂量标准的次级代谢产物对荷瘤动物的免疫刺激作用明显。因此,该次级代谢产物具有抗肿瘤免疫刺激作用。

豆类丝核菌次级代谢产物对小白鼠胎儿的致畸作用

将妊娠的雌鼠随机分为5组,分别灌胃给予生理盐水、10 mg/kg环磷酰铵(CP)及高、中、低剂量豆类丝核菌次级代谢产物(苦马豆素含量分别为56.62、14.15、3.54 mg/kg),临产前剖腹取出胎鼠,将1/2胎鼠用茜素红染色做骨骼畸形观察,另1/2胎鼠用Bouins染色做内脏畸形检查,研究豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠胎儿的致畸作用。结果显示,3个剂量组孕鼠增重、外观畸形率、骨骼畸形率、内脏畸形率与空白对照组均差异不显著(P>0.05),而与CP阳性对照组均差异极显著(P<0.01)。表明,在此剂量和条件下,豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠无明显母体毒性,对胎鼠无发育毒性和致畸作用。

豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠行为致畸学研究

研究了豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠后代的行为致畸作用。将5组孕鼠分为空白对照组、豆类丝核菌次级代谢产物低剂量组、中剂量组、高剂量组及阳性对照组,分别灌胃给予生理盐水、低剂量(SW含量3.54 mg/kg)、中剂量(SW含量14.15 mg/kg)、高剂量(SW含量56.62 mg/kg)豆类丝核菌次级代谢产物及10 mg/kg环磷酰铵(CP),待其自然分娩后,观察其后代生长发育及行为状态。结果表明,豆类丝核菌次级代谢产物3个剂量组在反射能力、协调运动能力、学习记忆能力及自主活动能力各方面指标与空白对照组相比差异均不显著(P>0.05),而与阳性对照组相比差异极显著(P<0.01)。在本实验的剂量和条件下,豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠后代不具有行为致畸作用。

豆类丝核菌次级代谢产物对动植物细胞损害作用的对比

目的探索豆类丝核菌或其次级代谢产物的动植物损害在细胞生物学上的作用,为苦马豆素(swainsonine,SW)的毒理学研究提供新的思路。方法通过制作豆类丝核菌次级代谢产物污染的饲料和人工污染豆类丝核菌饲料,饲喂家兔17d,剖检家兔并取其脑、肝脏、肾脏等组织分别进行病理组织学和电镜观察;并将不同浓度的次级代谢产物和不同株的豆类丝核菌分别污染回接的绿豆,待84h培养后,进行组织学和电镜观察。结果在对动植物细胞损害作用中,豆类丝核菌次级代谢产物使家兔脑组织和淋巴细胞呈现空泡变性,神经细胞核糖体脱颗粒,粗面内质网扩张等变化;同时还能使植物根部组织结构受损,细胞呈现空泡变性,内膜破裂等变化。结论豆类丝核菌引起的动物中毒作用主要是其次级代谢产物中SW发挥毒性,且同疯草中毒引起的病理变化基本一致;菌株对植物根部的致病性与其次级代谢产物中SW含量呈正相关。即推测,SW很有可能不仅是动物豆类丝核菌中毒的主要毒素,而且是豆科植物丝核菌病中细胞损害的主要化学物质。

豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠的一般生殖毒性

研究豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠的一般生殖毒性。昆明种小鼠80只,随机分为4组,每组20只,雌雄各半。设一个空白对照组和3个试验组,给药剂量分别为56.62、14.15和3.54 mg/kg。交配前雄鼠连续给药28 d,雌鼠连续给药14 d,雌雄按1∶1合笼交配,发现阴道栓之日定为受孕始日,交配后雌鼠继续给药13 d。结果表明,56.62 mg/kg对雄鼠、雌鼠、仔鼠均有影响,表现为雄鼠附睾质量(P<0.01)、附睾系数(P<0.05)、精子总数(P<0.01)的异常;雌鼠体质量的下降(P<0.05)以及仔鼠第4天成活率的降低(P<0.05)。14.15 mg/kg使雄鼠附睾质量(P<0.01)和附睾系数(P<0.05)降低并造成精子总数增多(P<0.05)。3.54 mg/kg对所有指标无显著影响(P>0.05)。因此,在本试验条件下,小鼠一般生殖毒性无作用剂量为3.54 mg/kg,相当于肿瘤有效治疗量的1.31倍。

豆类丝核菌次级代谢产物对肿瘤细胞超微结构的影响

通过建立种植性肝癌(H22)实体瘤动物模型,并给荷瘤小鼠灌胃含有苦马豆素(swainsonine,SW)且剂量分别为2.7mg/(kg·d)和16.2mg/(kg·d)的豆类丝核菌次级代谢产物稀释液,于灌药后16d剖检荷瘤动物并取肿瘤组织与肝组织制作超薄切片,透射电镜观察。结果表明,该次级代谢产物能抑制种植性实体瘤(H22)的生长和转移。因此,该次级代谢产物具有抗肿瘤药用价值。

豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠围产期毒性的研究

[目的]为豆类丝核菌次级代谢产物在临床上的安全用药提供试验依据。[方法]将受孕0 d的母鼠随机分为正常对照组,豆类丝核菌次级代谢产物56.62、14.15、3.54 mg/kg 4个组,研究豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠的围产期毒性。[结果]中剂量组母鼠21 d体重显著下降(P<0.05)。各试验组F1代小鼠出生胎数、0 d成活率与对照组无显著差异(P>0.05),而生长指数、内脏指数、游泳生存时间、生理发育指标、反射发育指标与对照组有显著或极显著差异。[结论]在该试验条件下豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠有围产期毒性,在临床上作为抗肿瘤药物使用时孕妇应禁用。

丝状真菌转录因子调控非核糖体肽合成酶介导的次级代谢产物合成研究进展

丝状真菌(Filamentous fungi)产生的次级代谢产物(Secondary Metabolites,SM)广泛应用于生物医药、生物防治及食品等领域。大多数SM的生物合成与非核糖体肽合成酶(Nonribosomal peptide synthetase,NRPS)的催化密切相关,故NRPS的表达调控对SM的生物合成至关重要。为了深入了解丝状真菌NRPS基因簇的表达调控模式,本文就通路特异性和全局性两种转录因子调控丝状真菌NRPS介导SM生成的研究进展进行了综述,以期深化对丝状真菌中转录因子调控NRPS介导的SM生成机制的认识,为丝状真菌天然产物的开发提供参考依据。

豆类丝核菌发酵代谢产物中苦马豆素的测定

利用气相色谱法,对实验室分离保存的6株豆类丝核菌发酵代谢产物中的苦马豆素(swainsonine,SW)进行了定性、定量分析。结果表明,豆类丝核菌发酵代谢产物中含有大量SW,其中02-6B与02-3A2株菌代谢产物中苦马豆素含量分别达到1093.17与1199.64mg/L,说明这2株菌可用于SW生物合成的研究,并有利于降低SW生物合成的成本。

CRISPR/Cas基因组编辑技术在丝状真菌次级代谢产物合成中的应用

丝状真菌能够合成抗生素、色素、酶制剂、激素等多种天然产物,广泛应用于医药、化工、农业和基础生物学研究等领域。丝状真菌遗传背景复杂,阻碍了对其的进一步开发利用。基因组编辑是基于核酸酶对基因组位点特异性序列进行靶向切割,产生双链断裂,从而通过非同源末端连接或同源重组进行修复的技术。其中,CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统是目前使用最普遍的基因组编辑技术,已在丝状真菌遗传育种、基因改造和多种天然产物合成等方面进行了大量应用。本文总结了丝状真菌CRISPR/Cas的技术原理、元件表达、递送方式及该系统在次级代谢产物等研究中的应用。对于脱靶效应以及转化率低的问题,本文讨论了可能的解决方法。在此基础上,展望了基于CRISPR/Cas的基因组编辑技术在真菌基因功能表征、天然产物合成代谢途径解析与重构、高效丝状真菌底盘细胞构建、天然产物合成等方面的应用。

木霉菌株Td31代谢产物对立枯丝核菌的拮抗作用

为了明确木霉菌株Td31代谢产物对植物病原真菌的拮抗作用,利用液体深层发酵法发酵木霉菌株Td31,过滤除菌制备代谢产物,采用生长速率法、显微观察法和盆栽试验法,研究了木霉菌株Td31代谢产物对立枯丝核菌的拮抗作用。结果表明:木霉菌株Td31的代谢产物可抑制立枯丝核菌菌丝的生长及菌核形成和萌发,其中以代谢产物稀释1倍处理的抑菌作用最强,菌丝生长抑菌率高达87.7%,并可完全抑制菌核的形成,菌核萌发抑制率为56.7%。随着木霉菌代谢产物浓度的降低其抑菌效果也随之下降,差异极显著。经木霉菌株Td31代谢产物处理的菌丝原生质浓缩、细胞质外溢、空胞化、细胞壁消解、菌丝解体。盆栽防病试验结果表明,木霉菌株Td31代谢产物浸种可以有效地防治茄子立枯病,用发酵液原液浸种,防病效果可达69.8%,代谢产物浓度越高,防病效果越好。代谢产物经121℃处理20min后,对抑菌活性和防病效果无明显影响,代谢产物中的主要抑菌活性物质可能是耐高温的抗生素。

马铃薯中立枯丝核菌代谢产物及生物活性研究

研究了马铃薯中立枯丝核菌的代谢产物。首先利用不同的有机溶剂萃取立枯丝核菌培养滤液并测定各组分生物活性,其次结合薄层色谱(TLC)与硅胶柱层析两种色谱分析方法对有毒性组分进行了分离纯化,最后利用紫外吸收光谱、红外吸收光谱和气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)等方法对立枯丝核菌毒素做了分析鉴定。结果表明:乙酸乙酯提取物的毒性高于氯仿提取物。硅胶柱层析中分离得到5个立枯丝核菌分离物(I_1、I_2、I_3、I_4、I_5)。紫外吸收数据表明,I_1在198.5 nm处有最大吸光度;红外光谱表明,I_1中有-CH_2(2927.41、2856.06 cm^(-1))、C=O(1735.62 cm^(-1))、C=C(1635.34 cm^(-1))、-CH_3(1417.42 cm^(-1))、-C-O(1263.1、1128.2 cm^(-1))等基团存在;GC-MS分析结果表明,I_1中的主要物质有磷酸三丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯和(甲氧基甲基)三苯基氯化磷几种物质。

大曲丝状真菌的物种多样性及其次级代谢产物的合成潜力

通过高通量测序研究了大曲中丝状真菌的物种多样性,并结合荧光定量PCR对丝状真菌进行了定量分析;此外,还通过纯培养对高温曲中的丝状真菌进行筛选,并使用简并引物对分离株的次级代谢产物合成酶基因进行扩增。结果表明,Thermomyces属的丰度随大曲温度的升高而上升,而Aspergillus属的丰度随大曲温度的升高而下降;丝状真菌在大曲中的生物量同样随大曲温度的升高而下降;利用纯培养的方法从高温大曲中分离得到50株丝状真菌,隶属于10个属(Aspergillus、Monascus、Byssochlamys、Lichtheimia、Rhizomucor、Mucor、Arthrinium、Alternaria、Thermomyces和Rasamsonia),并且这些丝状真菌含有多种次级代谢产物合成酶表达基因;大曲来源的丝状真菌具有强大的次级代谢产物合成潜力,大曲是优良的微生物和次级代谢产物生物合成的基因库,可能成为挖掘新天然产物的新来源。

极地真菌Geomyces sp.3-1次级代谢产物的研究

采用硅胶柱层析、ODS反相硅胶柱层析、凝胶柱层析和高效液相HPLC等色谱技术,对极地真菌Geomyces sp.3-1的发酵液提取物进行分离纯化,共得到8个化合物,通过波谱解析结合理化性质并比较相关文献,确定化合物为:paulownin(1)、demethylincisterol A3(2)、ergosta-7,22-dienen-3,6-dione(3)、citreoanthrasteroid B(4)、19-norergosta-5,7,9,22-tetraene-3β-ol(5)、(22E)-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol(6)、(3β,5α,6β,22E)-6-methoxyergosta-7,22-diene-3,5-diol(7)和ergosta-7,22-dien-3β-ol(8)。其中,化合物2~7均是首次从Geomyces属真菌中获得,化合物2有较好的抗菌和细胞毒活性。

极地真菌Geomyces pannorum SA3-2-YM次级代谢产物的研究

采用聚酰胺柱层析、硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶柱层析和高效液相HPLC等色谱技术,对极地真菌Geomyces pannorum SA3-2-YM的发酵液提取物进行分离纯化,共得到13个化合物,通过NMR和MS等波谱数据确定结构为:cyclo-(L-Trp-L-Pro)(1)、cyclo-(L-Trp-L-Tyr)(2)、cyclo-(Gly-L-Trp)(3)、cyclo-(L-Trp-L-Phe)(4)、cyclo-(L-Trp-L-Ser)(5)、cyclo-(L-Tyr-L-Pro)(6)、cyclo-(L-Trp-L-Ile)(7)、cyclo-(D-Ala-D-Trp)(8)、ergosterol(9)、(22E)-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol(10)、anicequol(11)、indazole(12)、p-hydroxybenzaldehyde(13)。其中,化合物1~9、11~13均为首次从地丝霉属的真菌中分离得到。抑菌试验表明化合物9对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌具有一定的抑制活性,其最小抑制浓度(MIC)均为90μg/mL。采用CCK-8法测试了13个化合物对四种肿瘤细胞株的体外细胞毒活性,化合物1~13对四株实验肿瘤细胞株表现出不同程度的抑制活性,其中环二肽化合物8对HeLa肿瘤细胞的抑制率可达62.28%,含有过氧基团的化合物10对SMMC-7721细胞的抑制率达到了68.13%。

小蓟内生真菌Chaetomium Bostrychodes次级代谢产物及其生物活性研究

目的:对一株小蓟内生旋丝毛壳菌(Chaetomium bostrychodes)次级代谢产物化学结构及生物活性进行研究。方法:利用柱层析、Sephadex-20、HPLC等方法对发酵产物进行分离纯化,经核磁共振波谱、高分辨质谱技术并结合参考文献确定化合物结构,采用二倍稀释法检测化合物的抗菌活性。结果:从上述发酵产物中分离得到9个单体化合物,分别为aurasperone A(1)、fonsecinone A(2)、granulolactone(3)、4-hydroxyphenylacetone(4)、latifolicinin C(5)、p-hydroxybenzoic acid ethylester(6)、p-hydroxybenzoic acid(7)、phallac acid A(8)、1,2,4-benzenetriol(9),以上化合物均为首次从该菌种中分离得到。对这些化合物的抗临床耐药细菌和植物病源真菌活性进行测试,结果显示均无显著抑制作用。

糖丝菌属次级代谢潜能分析及代表菌株基因编辑体系建立

【背景】稀有放线菌是发掘天然产物的“新矿藏”。糖丝菌(Saccharothrix)作为典型的稀有放线菌,其天然产物生产潜能尚需进行系统分析和发掘。此外,针对糖丝菌的基因编辑体系也鲜有报道。【目的】揭示糖丝菌属稀有放线菌合成不同结构类型天然产物的潜能,并建立代表菌株的基因编辑体系,推动新结构天然产物发现及相关生物合成研究。【方法】通过多位点序列分析(multi-locus sequence analysis,MLSA)方法评价已公布的34个糖丝菌基因组之间的相似度,利用antiSMASH分析基因簇及其合成产物的结构信息,并使用BiG-SCAPE对基因簇进行聚类分析。选择代表菌株澳大利亚糖丝菌(Saccharothrix australiensis)DSM43800和紫丁香糖丝菌(Saccharothrix syringae)NRRL B-16468,以整合型载体和基因敲除载体为工具,建立接合转移及基因编辑体系。【结果】对34个糖丝菌基因组的分析显示,共发现了1348个天然产物生物合成基因簇,平均每个基因组含有约40个基因簇。其中,合成聚酮、非核糖体肽、聚酮-非核糖体肽杂合产物,以及核糖体合成和翻译后修饰肽类天然产物的基因簇丰度较高。这1348个基因簇聚类成852个基因簇家族(gene cluster family,GCF),进一步聚集成130个基因簇集团(gene cluster clan,GCC)。本研究建立并优化了适用于澳大利亚糖丝菌和紫丁香糖丝菌的接合转移操作体系,并建立了2个代表菌株的基因编辑体系,获得了相应的突变菌株。【结论】糖丝菌作为稀有放线菌,其基因组内富含天然产物生物合成基因簇,展现出合成众多结构类型天然产物的强大潜能,尤其是聚酮与聚肽类天然产物。我们成功实现了对糖丝菌基因组的精准编辑,为深入研究基因簇及其合成的天然产物奠定了坚实的基础。

丝状真菌次级代谢产物生物合成的表观遗传调控

丝状真菌产生的次级代谢产物是新药的重要来源之一,其生物合成过程受到众多因素的调控。最近的研究表明,表观遗传对多种丝状真菌次级代谢产物的生物合成具有调控作用。DNA和组蛋白的甲基化与乙酰化修饰是目前所知的丝状真菌主要的表观遗传调控形式。通过过表达或缺失相关表观修饰基因和利用小分子表观遗传试剂改变丝状真菌染色体的修饰形式,不仅可以提高多种已知次级代谢产物产量,而且可以通过激活沉默的生物合成基因簇诱导丝状真菌产生新的未知代谢产物。丝状真菌表观遗传学正逐渐成为真菌菌株改良的新策略以及挖掘真菌次级代谢产物合成潜力的强有力手段。