豇豆胰蛋白酶抑制基因改良大白菜抗虫性的研究(英文)

以8个大白菜亲本材料无菌苗为实验材料,从近生长点处切下无菌苗子叶,在MS＋1 mg/L 2,4-D培养基上预培养48 h,以携带豇豆胰蛋白酶抑制基因（该基因可赋予大白菜抗菜青虫和小菜蛾等昆虫的抗性,Cowpea Trypsin Inhibitor gene,CpTI）的质粒pBinΩSCK为载体,通过OD600值约0.3～0.4的根癌农杆菌LBA4404侵染3min,在MS＋2 mg/L BA＋0.5 mg/L NAA＋5 mg/L硝酸银＋2%蔗糖＋8 g/L琼脂培养基上共培养48 h,将其转到含有卡那霉素和头孢霉素的筛选培养基中,约4周出现大量转化体,经分子杂交检测,证明了豇豆胰蛋白酶抑制剂基因整合到了大白菜基因组中,室内和田间的抗虫试验也表明,豇豆胰蛋白酶抑制剂基因赋予了转基因大白菜较强的抗虫能力.本研究还对影响农杆菌遗传转化效率及植株再生的各种因素进行了优化.

根癌农杆菌介导豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转入苹果主栽品种

研究建立起一套简单、高效的苹果遗传转化系统。利用根癌农杆菌介导的叶圆片转化法将高效启动子启动的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 (CpTI)转入富士、乔纳金、王林、嘎拉等苹果主栽品种中 ,经卡那霉素抗性、PCR、点杂交、Southern杂交检测证明了 4个品种均获得转化再生植株 。

转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因抗虫甘蓝植株的获得

利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)栽培品种“京丰”和“迎春”,并分别获得了转基因再生植株。对NPTⅡ的ELISA检测表明,标记基因NPTⅡ已在再生植株中得到有效表达。对转化植株进行Southern blot分子杂交实验进一步证明CpTI基因已整合到甘蓝的基因组。实验室内的叶片离体饲虫及盆栽饲虫试验表明,转基因甘蓝对菜青虫具有一定抗性。实验中还观察到,采用愈伤组织分化途径可以获得较高的转化频率,但嵌合体较多;而直接分芽的途径转化率低,但嵌合体较少。

转修饰豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)抗虫甜椒植株的获得

以 12～ 14d苗龄的甜椒带柄子叶为外植体 ,经根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)介导 ,将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 (sck)导入甜椒杂交种“中椒 5号”和常规种“茄门”中 ,在对甜椒转化系统和芽丛诱导茎伸长的条件进行优化研究后 ,获得了卡那霉素抗性植株 ,最高转化频率为 16 .7% .卡那霉素抗性筛选、PCR检测和Southernblot杂交均证实 ,nptII基因和sck基因已整合进甜椒基因组中 .室内离体叶片饲虫和田间自然抗虫性鉴定进一步证明 ,转基因植株对棉铃虫 (HeliothisarmigeraHubner)具有一定抗性 .图 4表 2参

豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转化芥菜及抗虫鉴定

用农杆菌介导将豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)基因导入芥菜 ,获得了Kan抗性植株 .经PCR扩增、PCR Southern印迹和Northern印迹分析 ,转化再生植株大部分呈阳性 ,而非转化的再生植株均为阴性 ,证明CpTI基因已存在于芥菜基因组中 .在室内进行了喂虫试验 ,结果表明转基因芥菜抗虫性明显高于对照 。

大白菜转修饰豇豆胰蛋白酶抑制剂基因获得抗虫植株

以大白菜 3d苗龄带柄子叶为外植体 ,经根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)介导 ,将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 (sck)导入大白菜自交系‘GP 1 1’和杂交种‘中白 4号’ ,并获得了卡那霉素抗性植株。PCR检测和Southernblot杂交证实 ,sck基因已整合进大白菜基因组中 ;豇豆胰蛋白酶抑制剂活性检测表明 ,大部分转基因植株都对牛胰蛋白酶有一定的抑制活性 ,对照未转化植株抑制活性很低。室内离体叶片饲虫和田间自然抗虫性鉴定进一步证明 ,转基因植株对菜青虫 (PierisrapaeL.)具有一定抗性。

豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)抗虫转基因新疆杨的获得

利用根癌农杆菌介导法将广谱抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)基因导入新疆杨 (Populusal bavar pyramidalis) ,经筛选获得了大量转基因植株。对转基因植株经PCR鉴定、PCR Southern和点杂交分子检测结果证实CpTI基因已整合进杨树基因组中。部分转基因植株的饲虫实验表明 。

豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(cpti)及其在抗虫转基因作物中的应用

豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor,CpTI)来自豇豆的可食用部分,由于其具有抗虫谱广且昆虫不易对其产生耐受性的特点,cpti基因被作为抗虫植物基因工程一个重要的候选基因。目前,cpti基因已经被转到烟草、水稻、棉花和番茄等多种作物中。本文介绍了CpTI的特性、抗虫机理、基因工程研究进展,以及转cpti基因水稻的安全性研究,并对蛋白酶抑制剂的分类和安全性问题做了相关介绍。CpTI在分类上属于Bowmun-Birk家族,大量医学研究表明,该家族蛋白质对于癌症的预防和辅助治疗都有积极作用,对人体不存在任何危害。

豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因转化欧美杨的研究

本研究建立了欧美107杨的高频再生体系,用改良的根癌农杆菌介导法将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入107杨中。经过严格的卡那霉素(Km)筛选,得到了Km抗性(Kmr)植株。对部分Kmr植株进行PCR及PCR-Southern杂交鉴定,证实CpTI基因已整合进杨树基因组中。转基因植株的饲虫实验表明,其中部分株系的叶片可在一定程度上抑制扁刺蛾幼虫的生长。

豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的克隆

利用 RT- PCR的方法 ,从豇豆种子、子叶及成熟叶片中分别提取 RNA,反转录后以该基因两端的保守序列为引物进行 PCR扩增 ,PCR产物与 p UCm- T载体连接进行克隆 ,蓝白筛选重组子 ,经测序 ,其核苷酸同源性高达 1 0 0 % ,蛋白质同源性达 91 %。本试验同时对该基因的表达时期差异进行了大致检测 ,结果是种子的表达量最高 ,子叶其次 。

豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转化花椰菜的研究

通过根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens介导,将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入花椰菜无菌苗的下胚轴和子叶中,卡那霉素(Kan)的筛选质量浓度为15 mg/L,抑制农杆菌生长的抗生素选用羧苄青霉素(carbencillin),质量浓度为500mg/L.对所获得的转基因植株进行PCR扩增,结果显示大多数为阳;PCR-Southern及Southern分子检测分析,结果证明CpTI基因已被整合到花椰菜植株的基因组中.转基因植株叶片的离体饲虫初步试验结果表明,对鳞翅目害虫菜青虫的生长发育有一定的抑制作用.

转基因抗虫作物中豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)酶联免疫检测方法的建立

从10个不同豇豆品种中筛选出抑制剂活性最高的901青皮豇豆,提取豇豆胰蛋白酶抑制剂。通过G-75凝胶过滤、亲和层析纯化了豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)并制备了其兔多克隆抗体。用所制备的抗体建立了酶联免疫检测方法并检测了转CpTI编码基因棉花、水稻中的CpTI含量,发现棉花不同器官CpTI的表达量不尽相同。

豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因在转基因水稻中的表达特性研究

以豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)转基因水稻自交品系和其衍生的花培品系为实验材料 ,通过PCR扩增和CpTI表达蛋白活性的测定 ,研究了CpTI基因的遗传稳定性和表达特性。结果表明CpTI基因在转基因自交后代可以稳定遗传 ,而在部分花培品系中发生丢失。同时CpTI基因的表达表现出一定的时空特性 ,同一转基因品系中叶片CpTI蛋白的表达活性通常高于茎杆 ,而不同发育时期的CpTI蛋白的表达活性以分蘖期最高。除花培品系DH4 0 1外 。

根癌农杆菌介导的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转化芥菜的研究

为得到具有较强抗虫性的新的芥菜种质资源,用农杆菌介导将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入芥菜,获得了Kan抗性植株。经PCR扩增、PCR Southernblot和Northernblot分析,转化再生植株大部分呈阳性,而非转化的再生植株均为阴性,证明CpTI基因已存在于芥菜基因组中。在室内进行了喂虫试验,结果表明转基因芥菜抗虫性明显高于对照,转基因植株之间存在抗虫性差异。

转修饰豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)玉米(Zea mays L.)植株的获得及其抗虫性分析

利用基因枪法将修饰的豇豆胰蛋白酶基因 (sck)导入玉米优良自交系E2 8及34 0的胚性愈伤组织中 ,经筛选剂PPT 3次筛选及再生过程 ,获得可育的再生植株。经PCR及Southernblot分子检测 ,证实所获得的再生植株为转基因植株。豇豆胰蛋白酶抑制剂抑制活性检测及抗虫结果显示 :外源基因在植物已获表达 ,部分转基因植株具有较强的抗虫活性。

豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)的克隆及其植物表达载体的构建

用CTAB法提取豇豆叶片总DNA后,根据基因两端的保守序列设计引物,经PCR方法扩增得到CpTI基因,将其克隆到pMD-18T载体上,酶切并测序鉴定,将该基因登陆到GeneBank(NO.EU088405)并进行同源性鉴定,证明该基因为丝氨酸蛋白酶抑制剂基因家族中的一员。在此基础上,将CpTI基因用限制性内切酶BamHⅠ/SacⅠ切下后,克隆到pCUbi1303的UBI启动子和NOS终止子之间。经PCR和酶切鉴定,得到了该基因的真核表达载体pCUbiCpTI1303,为下一步的转基因做好了准备。

豇豆胰蛋白酶抑制剂cDNA在大肠杆菌中的克隆与表达

从即将成熟的豇豆子叶中分离出总RNA,逆转录合成cDNA第一条链。参照已知的几种Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂基因序列,设计并合成了两段寡核苷酸引物,以单链cDNA为模板,进行PCR扩增,得到320bp的均一扩增产物,克隆到pBluescrip SK(+)的EcoRV位点上并转化大肠杆菌JM101。酶切图谱及DNA序列分析表明克隆到的片段含有编码完整80个aa的豇豆胰蛋白酶抑制剂结构基因和一段编码27aa的前导序列。利用限制酶NcoI对其前导序列进行缺失,只保留成熟蛋白结构基因上游第一个ATG密码子并克隆到大肠杆菌表达载体pKK233-2中进行表达研究,从转化细菌的提取物中检测到了外源CpTI基因表达产物对胰蛋白酶的抑制活力。

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的克隆及其转基因烟草抗虫性初探

从未成熟的大豆子叶中提取总RNA，利用RT－PCR方法扩增出大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因单一目的片段，克隆到pBluescriptKS（＋）SmaI位点上。序列分析表明，该基因与报导的序列高度同源：其核苷酸序列及推论的编码氨基酸序列的同源率分别为99．5％和98．2％。由此，构建了大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的植物高效表达载体pBinSKTI。并采用农杆菌介导的叶盘法转化了烟草，获得的转基因烟草再生植株经抗虫测试表明：与对照烟草相比，具有明显的抗棉铃虫能力。

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的分离及其在抗虫植物基因工程中的应用

大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有抗虫特性。从未成熟的大豆（ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＬ．）子叶中提取总ＲＮＡ，然后反转录成单链ｃＤＮＡ，以此为模板，用ＰＣＲ方法扩增出大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂基因，并克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）的ＳｍａⅠ位点上。序列分析表明：克隆片段大小为６６３ｂｐ，包含了基因完整的编码序列。编码多肽由２１７个氨基酸组成，其中包括Ｎ端２５个氨基酸组成的信号肽序列，１８１个氨基酸组成的成熟蛋白序列和Ｃ端１１个氨基酸组成的液泡定位信号序列。构建了此基因的一系列植物表达载体，用于烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）、水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）、棉花（ＧｏｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍＬ．）等作物的转化。利用棉铃虫（ＨｅｌｉｏｔｈｉｓａｒｍｉｇｅｒａＨｕｂｎｅｒ）对经ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ杂交验证获得的转基因烟草进行了抗虫测试，结果表明，转基因烟草和对照烟草相比，具有明显的抗虫能力。