豌豆根瘤菌SCAU P10的接种效果、促生特性及系统发育研究

【目的】为获得共生固氮能力强、抗逆促生效果好、宿主识别范围广的高效豌豆根瘤菌。【方法】以前期初筛的优良豌豆根瘤菌SCAU P10为材料,在四川省成都市金堂县和广元市剑阁县验证SCAU P10的田间接种效果,采用常规方法测定菌株的抗逆促生能力,用水培法研究菌株与四川主要豌豆品种“长寿仁”“中豌6号”“无须豆尖1号”“云豌91号”的共生匹配性,通过16S rRNA基因、持家基因、共生基因序列分析研究菌株的系统发育地位。【结果】金堂县豌豆接种供试菌株SCAU P10的鲜豌豆籽粒(青豌豆)显著增产32.3%,两试验地接种供试菌株的根瘤数、株高、绿肥产量(植株鲜重)、饲草产量(植株干重)、植株氮钾积累量均较不接种对照(CK)显著增加。抗逆促生特性试验表明,菌株耐酸耐碱能力均较强,可在pH 4.0~10.0条件下生长,耐盐能力较差,仅能在NaCl浓度0.01%~0.6%条件下生长,能分泌生长素(IAA),具有较强的溶磷(卵磷脂、磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝)和溶钾能力。匹配性试验表明,供试菌株SCAU P10与四川4个主要豌豆品种均高效匹配。16S rRNA基因、持家基因和共生基因综合分析表明,菌株SCAU P10归属于Rhizobium sophorae,且经历了共生基因的水平转移。【结论】豌豆根瘤菌Rhizobium sophorae SCAU P10与四川主要豌豆品种共生匹配性好,具有溶磷溶钾和分泌IAA的能力,pH生长范围较广,可有效促进豌豆生长及养分吸收。研究结果可为四川地区豌豆根瘤菌菌剂的研制、推广和应用提供一定的科学依据。

豌豆根瘤菌与新疆中华根瘤菌原生质体的属间融合研究

以青霉素和氯霉素分别作为RhizobiumleguminosorumUSDA2 370和SinorhizobiumxinjiangnesisCCBAU110的抗药性标记。利用原生质体融合技术 ,成功地获得了USDA2 370和CCBAU110的属间融合菌株。该融合菌株可分别在双亲寄主植物上结瘤。融合菌株在细胞形态、大小、菌落特征及蛋白质电泳图谱上与亲本菌株均有所不同。融合菌株与USDA2 370的DNA同源性为 5 6 6 % ,而与CCBAU110的DNA同源性为 10 2 %。

豌豆根瘤菌ohrB基因的抗氧化和共生固氮表型

采用基因敲除构建豌豆根瘤菌ohr B基因突变株,研究突变株的抗氧化和共生固氮表型。结果表明:ohr B基因不影响菌株在自生培养条件下的生长能力,但对氢过氧化枯烯(cumene hydroperoxyde,Cu OOH)、过氧化氢(H2O2)、次氯酸钠(Na Cl O)等氧化物敏感,且在Cu OOH胁迫下,相比野生型菌株,突变株的存活率显著下降。荧光定量RT-PCR结果显示,豌豆根瘤菌ohr B基因表达不受H2O2诱导,且ohr B基因的缺失对其他抗氧化基因的表达没有影响。共生实验表明,ohr B基因对根瘤菌共生固氮能力及根际定殖能力没有影响,但在7 d瘤龄的豌豆根瘤类菌体中表达水平显著提高,并对根瘤菌结瘤能力有影响。ohr B基因虽对豌豆根瘤菌的自生生长、共生固氮、根圈定殖没有影响,但在抗氧化及竞争结瘤中发挥重要作用。

半无叶型豌豆根瘤菌接种效应及其竞争结瘤能力分析

【目的】研究不同根瘤菌株对豌豆生长发育、产量及品质的影响,并分析比较不同根瘤菌株的竞争结瘤能力,筛选出与供试豌豆品种匹配较好的根瘤菌株。【方法】在盆栽条件下,应用湖南省华容县棉田低氮土壤,对加拿大半无叶型豌豆MISER分别接种9株豌豆根瘤菌(CCBAU 33109、CCBAU 43228、CCBAU 43227、CCBAU 43232、ACCC 16058、CCBAU 41242、CCBAU 43242及商用菌株F98-1和F98-4)。测定豌豆的生育时期;在豌豆盛花期测定豌豆的主要生育特征、根瘤菌的结瘤固氮性能,并用BOX-PCR指纹图谱技术测定根瘤菌的占瘤率;在成熟期测定豌豆的主要生育特征、产量、产量构成因子,及其干籽粒粗蛋白、粗纤维含量。【结果】与不接种对照(CK)相比,接种CCBAU 33109后,MISER盛荚期和成熟期分别延长4.1和7 d(P<0.05,下同);接种ACCC 16058后,主茎节数在成熟期分别比对照、F98-1和F98-4多2.8、3.8和2.9节,株高比F98-4高15.67%,粗蛋白含量比对照和F98-1分别提高9.88%和10.63%;接种CCBAU 41242后,豌豆单株籽粒鲜重比商用菌株F98-1提高40.46%;接种菌株CCBAU 43228的占瘤率最高,为57.50%。【结论】根据接种根瘤菌对豌豆生长发育、产量以及品质等方面的影响,结合各根瘤菌株的竞争结瘤能力,本研究筛选出较适于豌豆MISER的豌豆根瘤菌株CCBAU 33109、ACCC 16058、CCBAU 41242、CCBAU 43228。

豌豆根瘤侵染细胞发育中造粉体的研究

透射电镜研究表明 ,在豌豆根瘤侵染细胞发育过程中 ,造粉体的形态结构处在变化之中。在发育早期 ,造粉体较多 ,分布在细胞壁附近。它的基质很少 ,多含有呈长梭形的、电子密度非常低的淀粉粒 ,并有一些电子密度较高的条带结构。随着细胞的发育 ,造粉体逐渐移至胞间隙周围 ,不断变小 ,切面近似椭圆形或圆形。进一步发育时 ,造粉体中的淀粉粒越来越小 ,几乎都近似椭圆形或圆形。与此相反 ,造粉体基质明显增多 ,常含一些嗜锇颗粒 ,有时还有一种特殊的泡状结构。在衰老细胞中 ,造粉体很少 ,但不含淀粉粒的质体经常可见 ,在造粉体附近常有较多的线粒体和内质网。还讨论了豌豆根瘤侵染细胞中造粉体的变化规律及其与细胞发育和固氮的关系。

豌豆根瘤发育中侵染细胞核的超微结构变化

用透射电镜研究了豌豆根瘤发育中侵染细胞核的超微结构变化。早期发育的侵染细胞核较大 ,近似圆形或椭圆形 ,核膜开始内陷。随着细胞的发育 ,细胞核变小 ,形状趋向扁平 ,核膜内陷增加 ,逐渐出现浓的染色质。在细胞衰老后 ,细胞核再度减小 ,核膜内陷加剧 ,浓的染色质增多。在早期的解体细胞中 ,虽然细胞质、细胞器和类菌体已经消失 ,但细胞核仍然清晰可见 ,只是浓的染色质进一步增多 ,常常位于核膜附近和核膜上。还讨论了侵染细胞核超微结构的特征和对细胞衰老的稳定性。

OsmC基因在豌豆根瘤菌抗氧化和共生中的功能

为研究OsmC基因在豌豆根瘤菌抗氧化和共生固氮中的功能,以豌豆根瘤菌RL3841的OsmC基因为研究对象,通过同源重组获得了OsmC基因突变株RLOsmC.结果表明:OsmC基因突变不影响豌豆根瘤菌的自生生长能力,但对无机氧化物H_2O_2和低浓度有机氧化物氢过氧化枯烯(CuOOH)都十分敏感.突变株RLOsmC感染豌豆宿主能形成红色有效根瘤,但是其固氮酶活降低了18.3%.OsmC基因的表达不受H_2O_2的诱导,但在7 d根瘤类菌体中表达量显著上调.表明根瘤菌OsmC基因在共生和抗氧化功能中发挥了重要的作用.

豌豆根瘤脂质体的分布及形态特征

豌豆根瘤中有大量的脂质体 ,广泛分布于非侵染细胞和侵染细胞内 ,它既可以存在细胞质中 ,也可位于液泡里面。有时单个存在 ,有时又多个聚集在一起。非侵染细胞与侵染细胞相比 ,前者中的脂质体明显多于后者。这些脂质体近似圆形或椭圆形 ,表面无膜 ,电子密度较高 ,内部无固定的结构 ,常有一些细胞器位于它的附近。讨论了脂质体与细胞发育及细胞种类的关系。

发酵条件对豌豆根瘤菌细胞生长和辅酶Q_(10)合成的影响

以豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)1.1723为研究对象,对影响细胞生长和辅酶Q10合成的培养条件:温度、pH值、接种量、装液量、收集时间等进行了研究.结果表明:菌株的最适生长条件为pH值5.0,温度30℃,接种量体积分数2%,装液量25mL,培养时间24h,辅酶Q10的合成量最高.

箭舌豌豆根瘤液泡中细菌周膜来源的研究

电镜观察结果表明,幼龄箭舌豌豆根瘤侵染细胞的细胞质较少,中央是一些体积较大的液泡。细胞质中侵入线经常可见,由侵入线释放出来的细菌均有细菌周膜。这些细菌只位于细胞质中,不出现在液泡里面。成熟根瘤中的侵染细胞与此不同,它们中有大量的成熟侵染细胞,细胞质丰富,里面充满大量细菌,中央常有一个大液泡。当中央液泡发育到一定程度时,位于其附近的细菌可通过液泡膜内吞、液泡膜与细菌周膜融合及液泡膜破裂3种途径进入液泡,后一种途径常伴有寄主细胞质。液泡中的细菌绝大部分裸露在外,只有个别细菌具有细菌周膜且多位于液泡膜的破损处附近,因此细菌周膜可能是原来就有的。

豌豆根瘤菌gshR基因的抗氧化和共生固氮作用

目的:研究豌豆根瘤菌RL3841的谷胱甘肽还原酶编码基因gshR的功能.方法:采用基因同源重组构建了豌豆根瘤菌gshR基因突变株RLgshR,探讨了基因突变对根瘤菌抗氧化和共生固氮的影响,利用实时荧光定量RTPCR检测gshR基因的mRNA表达水平.结果:gshR基因缺失不影响菌株在AMS基础培养基中的生长能力,但突变株对氢过氧化枯(CuOOH)和较高浓度的H_2O_2氧化物敏感.结论:gshR基因突变株RLgshR形成正常固氮根瘤,gshR基因的表达不受H_2O_2和共生环境诱导.

豌豆根瘤菌共生基因在S.fredii中的表达及共生质粒间的相互作用

通过两亲本接合转移 ,将豌豆根瘤菌 ( Rhizobium leguminosarum bv. viciae) 12 2 9的约 2 5 5 0 kb的共生质粒 p Sym12 2 9分别转入费氏中华根瘤菌 ( Sinorhizobium fredii) HN0 1SR及其消除了共生质粒的菌株 HND10 0中 .在人工培养条件下 ,用 1 4C标记的薄层层析 ( TL C)技术检测转移接合子的结瘤因子 ( L COs)的结果表明 ,转移接合子 HND10 0 ( p Sym12 2 9)产生的 L COs与豌豆根瘤菌 12 2 9相同 .植物盆栽结瘤试验结果表明 ,HND10 0( p Sym 12 2 9)能够在豌豆品种 Nigra上形成白色球状的无效根瘤 ,而豌豆根瘤菌 12 2 9则形成正常的长圆柱状的有效根瘤 .将 p Sym 12 2 9转入 HN 0 1SR后 ,部分接合子表现出与 HND10 0 ( p Sym 12 2 9)相同的结瘤性状 ,而另一部分接合子的结瘤性状与 HN0 1SR相同 ,显示了 HN0 1SR与 12 2 9两菌株异源共生质粒之间结瘤功能的抑制关系 .

豌豆根瘤菌透性酶基因突变体的构建及其功能研究

为研究豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)3841透性酶基因rl1568的作用,通过同源重组构建了豌豆根瘤菌透性酶基因rl1568突变体。结果表明,rl1568基因突变不影响菌株在自生培养条件下生长,但该基因突变株对低浓度的氧化物十分敏感且生长较差。荧光定量RT-PCR结果表明,H2O2不能诱导rl1568基因表达。植物盆栽试验发现rl1568基因突变对根瘤菌共生固氮能力无影响。

豌豆根瘤菌RND外排转运基因tpaA的功能研究

Rhizobium.leguminosarum 3841 tpaA基因编码RND家族内膜外排转运蛋白,RND外排泵的过量表达是革兰阴性菌细菌抗生素耐药性形成的重要原因之一.采用基因同源重组构建豌豆根瘤菌tpaA基因突变株RLtpaA,并研究了该基因突变对根瘤菌生长、抗生素耐药性以及共生固氮的影响.结果表明,tpaA基因突变会使根瘤菌在AMS基本培养基生长延迟,但不影响其在TY天然培养基中的正常生长.tpaA基因突变可能抑制了根瘤菌中的RND家族外排泵的过量表达,从而使其抗生素耐药性降低.接种了tpaA基因突变株的豌豆植株能形成红色有效根瘤,但其接种根瘤固氮酶活性降低.实时荧光定量RT-PCR分析表明tpaA基因在根瘤类菌体中的表达显著上调.

豌豆根瘤菌转移接合子侵染的白三叶草根部形态特征研究

以三叶草根瘤菌野生型菌株Rhizobium trifolii ANU 843的寄主范围基因转移豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)菌株300所获得的转移接合子290接种白三叶草。接种后24小时根毛细胞开始形成典型的弯曲;接种后48小时根毛细胞壁被部分溶解,在被侵染的根毛细胞中可观察到侵染线,皮层细胞大量分裂。植物接种试验表明,白三叶草接种豌豆根瘤菌菌株300的不结瘤,而接种转移接合子290和菌株ANU 843的能结瘤,表明三叶草根瘤菌的寄主范围基因导入豌豆根瘤菌,改变了豌豆根瘤菌的寄主范围,因而能够诱导白三叶草正常结瘤。

不同地理环境下野豌豆根瘤菌的遗传多样性与共生进化研究

【目的】研究西北部分地区不同地理环境下,野豌豆根瘤菌的遗传多样性及其共生进化间的关系。【方法】采用16S rDNA PCR-RFLP与16S rDNA全序列分析技术,对分离自陕西秦岭北麓红河谷、陕西南部汉中、甘肃沙漠绿洲带永昌混山窑、甘肃中部永登红城和新疆乌鲁木齐的5个不同地理环境(分别记做A、B、C、D、和E)的42株野豌豆根瘤菌,进行了遗传多样性和系统发育分析。【结果】测试根瘤菌共有6种基因型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ),基因型Ⅰ根瘤菌在各个地理环境采样点均有分布,并且A地点分布的所有菌株均属于该基因型,基因型Ⅱ菌株分布于D和E采样地点,基因型Ⅲ菌株分布于B、C和D采样地点,基因型Ⅳ分布于E地点,基因型Ⅴ和Ⅵ测试菌株均分布于D地点。由16S rDNA全序列分析可知,基因型Ⅰ根瘤菌的代表菌株CCNWSX0050和基因型Ⅳ根瘤菌的代表菌株CCNWGS0055分别与Rhzobium leguminosarum的相似性为99.8%和99.7%;基因型Ⅲ根瘤菌的代表菌株CC-NWGS0062与Sinorhizobium meliloti的相似性为100.0%。【结论】中国西北地区野豌豆根瘤菌在分类学上属于Rhizobium leguminosarum根瘤菌和S.meliloti根瘤菌,野豌豆-根瘤菌的共生关系在不同地理环境中表现出差异性。

豌豆根瘤侵染细胞衰老过程的电镜观察

用透射电镜观察了豌豆根瘤侵染细胞在衰老过程中的超微结构变化,结果表明,侵染细胞和拟菌体的衰老有一定的规律和特征,首先是一些包裹拟菌体的包囊变得疏松,包囊和拟菌体之间出现较大间隙,间隙中常有一些纤维状和泡状物质。然后,细胞质失去正常结构,逐渐凝聚为染色很深的团块,进而完全泡状化。伴随着拟菌体的衰老,寄主细胞质染色由深变浅,细胞器逐渐减少。最后,液泡和质膜相继破裂,细胞完全瓦解。有时在衰老细胞的胞间隙,或在衰老的细胞质中有一些年轻的细菌,甚至在一片崩溃的拟菌体中还有侵染丝,有的还正在向寄主细胞质释放细菌。

以麦秸为基质豌豆根瘤菌的压力脉动固态发酵

Rhizobium leguminosarum\ L003,a kind of biofertilizers,was cultured in a periodic air pressure oscillating,solid\|state fermenter by using straw of wheat as an inert solid support.Effects of air pressure oscillation amplitude,frequency on the viable cells of \R.leguminosarum\ L003 and oxygen transfer rate were investigated.It was found that enhanced oxygen transfer and biochemical reaction occurred in this system.Under the optimized conditions,about a 3\|fold increase of the viable cells was obtained in this system compared with that in a static tray fermenter.The overall oxygen transfer rate reached 487.01 mmol/(kg\5h)in this system in case of 0.35 MPa, t \-2=0.5 min against 37.46 mmol/(kg\5h) in static tray fermenter.

豌豆根瘤菌结瘤基因启动子内二级结构区与转录活性有关

用羟胺随机改变豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)结瘤基因 nodD上游的调控区间的核苷酸顺序,将它们插入广谱转录质粒pMP220的LacZ基因前,启动LacZ基因的表达、突变表明与结瘤基因的转录活力有关.DNA序列分析发现,这些突变都在距nodD基因起始密码子约80bp的二级结构区内.

豌豆根瘤细菌周膜在发育中的变化

细菌周膜随发育不同而异。侵入线中的细菌没有细菌周膜,刚从侵入线释放到寄主细胞质中的细菌虽有这一特殊结构,但一般较小,表面光滑。然后随着发育而不断变大,有的表面甚至出现凹凸不平。在这些细菌周膜附近,常有一些高尔基体和内质网,有的还有一些纤维状物质和泡状结构位于它所包围的电子透明区域中。当细菌周膜继续向外扩展时,常与相邻细菌周膜相互嵌合,进而彼此融合。这种融合是一种不对称性融合,只出现在即将或已成熟的被侵染的细胞中。细菌周膜融合可能与共生体系的固氮和物质交换有关。