豌豆清蛋白1(PA1)基因的克隆及对苜蓿的转化

本研究用PCR方法从豌豆(食荚大菜豌)克隆出富含硫氨基酸、同时具有抗虫作用的双功能的蛋白质基因-豌豆清蛋白1(PA1)基因,并构建了植物表达载体pCAMBIAl301-PA1。采用农杆菌介导法转化了紫花苜蓿,并对其转化体系进行了优化,得到了多个转基因胚性愈伤组织及其再生植株。PCR和Southern杂交检测表明,PA1基因和潮霉素抗性基因已被整合到了宿主细胞。SDS-PAGE分析表明该基因在再生植株中有一定表达。游离氨基酸分析表明,PA1基因的表达转基因苜蓿中蛋氨酸和半胱氨酸的含量从0.1%提高到0.4%。

清肝降脂方对脂肪变性LO2细胞HO-1、Egr-1基因及蛋白表达的影响

目的:通过建立游离脂肪酸体外诱导的LO2细胞非酒精脂肪肝模型,探讨不同剂量的清肝降脂方对肝脏脂肪变LO2细胞HO-1、Egr-1基因及蛋白表达水平的影响。方法:建立游离脂肪酸诱导脂肪变性LO2肝细胞体外模型。人肝LO2细胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养,待细胞均匀分布,随机分为6组:正常对照组、模型组、清肝降脂方高剂量组、中剂量组、低剂量组、水林佳对照组,每组6瓶。除正常对照组外,其余5组细胞均以0.5 mmol/L的游离脂肪酸诱导LO2非酒精脂肪肝细胞模型,诱导24 h后,各组随机抽取1瓶进行油红O染色,观察LO2细胞的脂肪化程度。确定模型诱导成功后,正常对照组和模型组分别加入10%正常大鼠血清,低、中、高剂量清肝降脂方药物血清组及水林佳药物血清组添加10%含相对应药物的大鼠血清,培养24h后,收集细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测血红素氧化酶-1(HO-1)、早期生长反应因子-1(Egr-1)的基因及蛋白表达水平。结果:与正常对照组比较,模型对照组LO2细胞HO-1、Egr-1 mRNA和蛋白表达有所增加;与模型对照组比较,自拟清肝降脂方三剂量组和对照药物组HO-1 mRNA及蛋白表达有所增高,Egr-1mRNA和蛋白表达明显降低;与对照药物组比较,清肝降脂方高剂量组HO-1 mRNA表达有所增高,Egr-1 mRNA表达有所降低。结论:Egr-1高表达可能会导致肝损伤机制之一;HO-1高表达可能是保护肝损伤机制之一;两者可能都是通过调节TNF-α表达来调节NAFLD细胞的损伤进展。清肝降脂方可明显改善LO2细胞Egr-1、HO-1 mRNA及蛋白的表达,可能为其治疗机制、临床诊断和判断进展参考指标。

牦牛垂体特异转录因子-1、生长激素和α-乳清蛋白基因多态性的分析

利用PCR-RFLP技术分析了麦洼牦牛、九龙牦牛和西藏牦牛GH、Pit-1和α-LA基因的多态性。采用普通牛所用的PCR引物均能在牦牛上正确地扩增出上述几个基因相应大小的片段。GH、Pit-1和α-LA(-1689)基因特定位点均未检测到多态性,基因型分别为AA、BB和AA;利用PCR-RFLP分析牦牛乳蛋白基因型具有准确、快速的特点,并能对新生牦牛和公牦牛乳蛋白或泌乳相关基因型进行分析。

牛血清清蛋白在小鼠骨肉瘤模型PCR基因分型中的应用

目的验证在PCR反应体系中加入牛血清清蛋白(BSA)可否提高小鼠骨肉瘤模型floxed Rb1基因杂合子和纯合子的检出率与准确率。方法以小鼠骨肉瘤模型子代小鼠基因组DNA为模板,进行Rb1基因的PCR基因分型。对在PCR反应体系中添加适量浓度(0.16 mg/mL)的BSA与不加BSA的PCR基因分型结果相比较。PCR引物序列涵盖Rb1基因外显子19两侧或3'端的LoxP序列。结果反应体系中添加BSA后,可成功获得PCR扩增条带:单一650 bp或247 bp(野生型)、单一700bp或295 bp(floxed Rb1基因纯合型)以及650 bp和700 bp(或247 bp和295 bp)混合条带(floxed Rb1基因杂合型),而反应体系中未加BSA的则无PCR扩增条带产生。结论 BSA可显著提高floxed Rb1基因的扩增效率,增加了该基因杂合子和纯合子的检出率并排除了假阴性结果,对于难以扩增的靶基因序列的PCR基因分型具有借鉴意义。

清血毒胶囊对银屑病模型小鼠的治疗效果及皮损部HDAC1、Gli1蛋白表达的影响

目的:观察清血毒胶囊对银屑病模型小鼠治疗效果及组蛋白脱乙酰基酶1(HDAC1)、胶质瘤相关癌基因蛋白-1(Gli1)表达的影响。方法:60只BALB/c小鼠随机分为空白组、模型组、甲氨蝶呤组、清血毒胶囊低剂量组、清血毒胶囊中剂量组和清血毒胶囊高剂量组,每组10只。采用5%咪喹莫特软膏制备寻常型银屑病小鼠模型,同时予治疗药物干预,各组均连续干预7 d。观察记录各组小鼠(第1天、第3天、第7天)皮损颜色、鳞屑程度、皮肤厚度并予银屑病皮损严重程度指数评分(Psoriasis Area and Severity Index,PASI);干预结束后,取皮损组织通过苏木精-伊红(HE)染色检测皮肤组织病理学变化并予Baker法评分;蛋白免疫印迹法检测皮损部HDAC1和Gli1的蛋白表达。结果:不同时间(第1天、第2天、第3天)之间小鼠PASI评分表达比较,差异有统计学意义(P<0.05),即存在时间效应。除空白组外,其余各组小鼠的PASI评分均逐渐上升。6组小鼠PASI评分总体比较,差异有统计学意义(P<0.05),即存在分组效应。时间因素和组别因素对PASI评分的影响存在交互效应(P<0.05)。干预7 d后,与空白组比较,模型组小鼠PASI评分、Baker法评分及HDAC1和Gli1的蛋白相对表达量均明显升高(P<0.05);与模型组比较,甲氨蝶呤组和清血毒胶囊中、高剂量组小鼠PASI评分、Baker法评分及HDAC1蛋白相对表达量均明显降低(P<0.05),清血毒胶囊低、中、高剂量组Gli1蛋白表达相对表达量均明显降低(P<0.05),且与药物浓度成负相关。结论:清血毒胶囊干预银屑病小鼠疗效肯定,其可能通过抑制HDAC1的表达,调控hedgehog(Hh)信号通路转录因子Gli1表达,抑制银屑病角质形成细胞异常增殖,发挥干预银屑病的作用。

奶牛乳蛋白基因多态性研究进展

乳中蛋白质由酪蛋白和乳清蛋白组成。酪蛋白包括αs1-酪蛋白（αs1-Casein，αs1—CN）、αs2-酪蛋白（αs2-Casein，αs2-CN）、κ-酪蛋白（κ-Casein，κ-CN）和β-酪蛋白（β-Casein，β-CN）。乳清蛋白包括α-乳清蛋白（α—Lactalbumin，α—La）和β-乳球蛋白（β-Lactoglobumin，β-Lg）。编码乳蛋白的基因都位于常染色体上，并且呈共显性。

可溶性TGF-β_1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建表达人TGF—β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础. 方法:以RT—PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM—T—Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA 技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度. 结果:经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系. 结论:成功构建了重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN, 可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.

基于PINK1/Parkin及cGAS/STING通路探讨滋水清肝饮的抗抑郁机制

目的研究滋水清肝饮对抑郁大鼠脑内PTEN诱导激酶1(PINK1)/Parkin及环磷酸鸟苷-腺苷磷酸合成酶(cGAS)/干扰素基因刺激因子(STING)信号通路的影响,揭示滋水清肝饮治疗抑郁症的抗炎机制。方法将60只大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组及滋水清肝饮低、中、高剂量组,每组12只。除对照组外,其余各组制备慢性不可预知应激模型(CUMS)抑郁模型。滋水清肝饮低、中、高剂量组分别灌胃12、24、48 g/kg滋水清肝饮水煎剂,对照组、模型组灌胃等体积的蒸馏水,1次/d,持续4周。采用强迫游泳、旷场实验及糖水消耗实验检测各组大鼠行为学变化;采用HE染色观察内侧前额叶皮层细胞结构;采用ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α及干扰素-γ(IFN-γ)水平;采用Western blot检测前额叶皮层PINK1、Parkin、cGAS、STING蛋白表达。结果行为学检测结果显示,与模型组比较,滋水清肝饮各剂量组大鼠在强迫游泳实验中进入第1次不动状态潜伏期延长(P<0.05),不动时间缩短(P<0.05);在中央区停留时间增加(P<0.05),进入中央区的潜伏期缩短(P<0.05);糖水消耗百分比明显升高(P<0.05)。HE染色结果显示,滋水清肝饮各剂量组大鼠前额叶皮层细胞核固缩现象减少,神经元数量增加,分布均匀。滋水清肝饮各剂量组大鼠前额叶皮层IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平降低(P<0.05),前额叶皮层PINK1、Parkin蛋白表达增加(P<0.05),cGAS及STING蛋白表达降低(P<0.05)。结论滋水清肝饮可改善CUMS大鼠的抑郁行为,改善神经元损伤及神经炎症反应,其机制可能与上调PINK1/Parkin信号通路蛋白表达,抑制cGAS/STING通路信号蛋白表达有关。

pSLX-CMV/TβRII-IgG1Fc载体的构建

目的构建表达人TGFβ1II型受体细胞外结合区和人IgG1Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础。方法以RTPCR方法扩增目的基因TβRIIIgG1Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEMTEasy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRIIIgG1Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pSLXCMV中,重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度。结果经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确无误,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系。结论成功构建了重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径。

微残清颗粒逆转复发/难治性急性髓系白血病(非APL)耐药的临床观察

[目的]观察微残清颗粒逆转复发/难治性急性髓系白血病(R/R AML)耐药的疗效及其机制。[方法]将纳入的72例R/R AML患者随机分为治疗组(39例,微残清颗粒联合常规化疗)和对照组(33例,单用常规化疗)。统计分析两组治疗前后血常规、骨髓原始细胞比例、微小残留病(MRD)、WT1、骨髓缓解率、总生存率(OS)、缓解时间(RT)和不良反应。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞术法检测治疗前后患者骨髓细胞多药耐药基因1(MDR1)、P-糖蛋白(P-gp)和细胞周期。[结果]治疗后两组骨髓原始细胞(原始+幼稚)比例和外周血白细胞计数均明显改善(P<0.05);治疗后与对照组比较,治疗组在外周血象和骨髓原始细胞比例方面均得到明显改善(P<0.05)。治疗后两组MRD、WT1水平均较治疗前降低,但与对照组比较治疗组MRD、WT1水平降低较显著(P<0.05)。治疗后骨髓缓解率治疗组(61.54%)明显高于对照组(36.36%,P<0.05)。治疗后12个月总生存率治疗组(69.23%)高于对照组(45.45%,P<0.05),但24个月总生存率治疗组(40.05%)与对照组(27.27%)比较无统计学差异(P>0.05)。对照组12例患者骨髓缓解,最长缓解时间21个月,最短缓解时间5个月,中位缓解时间8.5个月,平均缓解时间9.83个月;治疗组有24例患者病情缓解,最长缓解时间21个月,最短缓解时间2个月,中位缓解时间14个月,平均缓解时间13.63个月。两组之间的平均缓解时间有统计学差异(P<0.05)。治疗后治疗组的P-gp比例低于对照组(P<0.05),而对照组的MDR1表达增加,治疗组的MDR1表达显著降低(P<0.05)。治疗后,治疗组骨髓细胞周期S期和G2/M期比例增加,G0期比例下降,与治疗前和对照组相比有统计学差异(P<0.05)。两组均有骨髓抑制、胃肠道反应、肝肾功能不全、脱发等不良反应,对症治疗后改善,两组不良反应发生率未见统计学差异。[结论]微残清颗粒联合化疗可提高R/R AML患者的临床疗效,其机制可能与微残清颗粒降低MDR1编码P-gp蛋白的表达,诱导白血病细胞进入细胞周期,从而提高化疗药物的敏感性有关。

参黛清肠汤对溃疡性结肠炎小鼠肠道黏膜保护作用及机制探讨

目的观察参黛清肠汤对溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)小鼠肠道黏膜的保护作用,并探讨其机制。方法55只C57BL/6小鼠以2.5%葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)灌胃3个周期诱导建立UC模型,建模成功后随机分为5组,另10只C57BL/6小鼠记为正常组。美沙拉嗪组予以200 mg/kg小鼠体质量的美沙拉嗪溶于1 mL/100 g小鼠体质量生理盐水中灌胃,参黛清肠汤低、中、高剂量组分别予以15、30、60 mg/kg参黛清肠汤同法灌胃,模型组和正常组均予以等量生理盐水灌胃,1次/d,给药2周。干预后评价各组疾病活动指数(disease activity index,DAI)和肠道黏膜损伤指数(colonic mucosal damage index,CMDI);苏木素-伊红(HE)染色观察肠道黏膜病理改变;酶联免疫法检测肠道黏膜组织白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;实时反转录荧光聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blotting,WB)分别检测肠道黏膜组织Ras同源基因家族A(RhoA)、Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK-1)、Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac-1)、p21激活激酶1(PAK-1)、核转录因子-κB(NF-κB)mRNA和蛋白表达。结果HE染色证实UC小鼠建模成功;模型组DAI和CMDI评分,肠道黏膜组织IL-1β、TNF-α含量,肠道黏膜组织RhoA、ROCK-1、NF-κB mRNA及蛋白表达均高于正常组(P<0.05),美沙拉嗪组和参黛清肠汤3剂量组均低于模型组(P<0.05),参黛清肠汤低剂量组均高于美沙拉嗪组(P<0.05),参黛清肠汤高剂量组均低于美沙拉嗪组(P<0.05),模型组肠道黏膜组织Rac-1、PAK-1 mRNA及蛋白表达均低于正常组(P<0.05),美沙拉嗪组和参黛清肠汤3剂量组均高于模型组(P<0.05),参黛清肠汤低剂量组均低于美沙拉嗪组(P<0.05),参黛清肠汤高剂量组均高于美沙拉嗪组(P<0.05),且参黛清肠汤中剂量组与美沙拉嗪组差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组肠道黏膜组织病理改变严重,美沙拉嗪组和参黛清肠汤3剂量组病理改变均减轻,且参黛清肠汤高剂量组效果最佳。结论参黛清肠汤能减轻UC小鼠病变,保护肠道黏膜组织,减轻炎症损伤,推测与抑制RhoA/ROCK通路,下调RhoA、ROCK-1与NF-κB表达,上调Rac-1、PAK-1表达有关。

利用豌豆植物瞬时表达抗虫蛋白PA1b

PA1b是一种来源于豌豆种子的生物活性多肽,具有非常重要的生物杀虫活性,本研究以豌豆幼苗为材料,利用RT-PCR技术克隆抗虫基因PA1b,通过酶切连接技术构建了适用于豌豆植物的瞬时表达载体pCAPE2-PA1b,转化农杆菌GV3101后,利用真空侵染技术将含有PA1b及报告基因GFP的农杆菌分别接种发芽的豌豆种子,在0.08 MPa真空条件下侵染3~5 min后播种豌豆种子,预期在豌豆幼苗中瞬时表达抗虫蛋白PA1b,幼苗出土后利用手提式紫外灯跟踪观察,在报告基因GFP表达高峰期(幼苗出土后5~7 d)提取豌豆幼苗可溶性总蛋白,利用His标签抗体检测豌豆抗虫基因PA1b的表达,实验结果表明抗虫基因PA1b在豌豆幼苗中成功表达,为进一步分析PA1b抗虫机制提供基础。

高迁移率族蛋白B1对小鼠巨噬细胞细胞因子和黏附分子表达的影响

目的观察高迁移率族蛋白B1（HMGB1）对小鼠腹腔巨噬细胞肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-10及细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达的影响。方法分离小鼠腹腔巨噬细胞，经不同质量浓度（0、1、10、100、1000ng／m1）HMGB1的刺激，于不同时间点（0、6、12、24、48、72h）采用实时荧光定量PCR方法测定细胞TNF-α、IL-10及ICAM-1mRNA表达的变化，同时应用酶联免疫吸附试验检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-10以及sICAM-1蛋白水平的变化。数据采用单因素方差分析。结果1～1000ng／ml的HMGB1作用24h，可使巨噬细胞的TNF-α、ICAM-1基因表达增加，与对照组比较差异具有统计学意义（P〈0．01），其中1000ng／ml HMGB1的作用最强，呈剂量一效应关系。而IL-10仅在1000ng／ml HMGB1作用时表达有所增加。以100ng／ml的 HMGB1作用不同时问后，培养上清液TNF-α与sICAM-1的浓度48h达高峰（P〈0．01），呈时间一效应关系，HMGB1对巨噬细胞TNF-α的分泌呈“双峰”特征，而IL-10水平无明显变化。结论一定浓度的HMGB1可诱导巨噬细胞合成、释放促炎细胞因子与黏附分子，具有显著的促炎特性。

反义转化生长因子-β1基因对骨肉瘤细胞表达转移相关因子的影响

目的 探讨反义转化生长因子(TGF) β1基因转染对骨肉瘤细胞MG 63表达基质金属蛋白酶(MMPs)和尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA )等肿瘤转移相关因子的影响。方法 将反义TGF β1基因转染MG 63 ,G418筛选转染细胞后,采用Northernblot法检测转染细胞MMP 2、MMP 9和uPA的表达情况。结果 反义TGF β1基因转染骨肉瘤细胞上清培养的Mv 1 Lu细胞增殖活性为0 .975±0 .0 16(对照组1.0 3 2±0 .0 2 7,P >0 .0 5 ) ;Northernblot法检测显示MMP 2和uPAmRNA的表达明显降低。结论 通过反义基因技术阻断骨肉瘤细胞TGF β1自分泌环,在降低肿瘤细胞TGF β1表达的同时,也降低了转移相关因子MMP 2、uPA的表达。

多药耐药肝癌细胞模型的建立

目的:构建人多药耐药基因(MDR1)的肝脏特异性真核表达载体,转染HepG2细胞,建立多药耐药肝癌模型。方法:将小鼠清蛋白启动子序列(pALB)克隆到已成功构建的MDR1基因真核表达载体pcDNA-MDR1中,替换其中的CMV启动子序列,构建MDR1肝脏特异性真核表达载体pcDNA-ALBMDR1,利用KeyGenTransⅢ阳离子转染试剂转染HepG2细胞,用G418筛选稳定表达MDR1基因的细胞,并用RT-PCR方法检测MDR1基因的表达,通过测定细胞对阿霉素的耐受性以及阿霉素与多药耐药逆转剂维拉帕米联合用药情况确定MDR1基因在肝脏细胞中的功能。结果:酶切鉴定和测序结果证明构建的重组表达载体pcDNA-ALBMDR1序列正确。RT-PCR分析以及荧光显微镜观察结果表明:该表达载体已在HepG2细胞中有效转录并稳定表达。MTT药敏实验结果显示:转染pcDNA-ALBMDR1质粒的HepG2细胞对阿霉素的耐药性有显著提高,同时维拉帕米能够显著提高转染细胞对阿霉素的敏感性。结论:成功构建了稳定表达MDR1并具有多药耐药特性的肝癌细胞模型,该模型的建立将有助于多药耐药逆转剂的筛选与研究。

外源性硫化氢对哮喘大鼠细胞因子及肺Muc5ac表达的影响

目的观察卵清蛋白(OVA)诱导建立的急性支气管哮喘大鼠模型,采用外源性硫氢化钠(NaHS)处理后Th1/Th2细胞因子及肺部黏蛋白基因Muc5ac的表达情况,探讨气体信号分子硫化氢(H2S)在哮喘发病中的作用。方法26只健康SD大鼠按照随机数字表法分为正常对照组(A组)、哮喘组(B组)和NaHS干预组(C组),每组分别为8只、9只、9只。激发24h后解剖大鼠,取腹腔静脉血检测其IL-4及IFN水平。取肺组织观察大鼠支气管周围的炎性细胞浸润程度并进行评分;采用免疫组织化学染色法测定大鼠肺中Muc5ac的表达情况。结果光镜下哮喘大鼠支气管周围炎性细胞浸润程度评分(采用中位数表示)A组1分,B组4分,C组2分,3组间比较差异有统计学意义(H=13.75P<0.05)。A、B、C组血浆IL-4水平分别为(99.25±31.60)、(185.40±139.30)和(262.00±27.10)pg/L,3组间比较差异有统计学意义(F=7.706P<0.05)。A、B、C组IFN-γ水平分别为(177.2±73.0)、(91.8±32.3)和(120.7±31.5)pg/L,3组间比较差异有统计学意义(F=6.731P<0.05)。A、B、C组肺Muc5ac蛋白水平(用阳性面积表示)分别为(501.75±270.58)、(1330.22±662.87)和(715.88±282.49)μm2,3组间比较差异有统计学意义(F=11.82P<0.01)。结论哮喘大鼠黏蛋白基因Muc5ac表达增加,外源性H2S可减轻哮喘呼吸道炎性反应,对哮喘急性发作起保护作用。