罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)致病性豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的分离鉴定及其特性分析

近年来细菌性疾病因病原菌种类繁多、覆盖区域广而影响了其养殖业的健康发展,造成较大的经济损失。从体表具有黑斑、肢体残损症状的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)肝胰腺组织中分离得到1株病原菌,通过形态学观察、生理生化特性鉴定、16S rRNA序列和特定毒力基因检测鉴定,以及人工回归感染试验和药敏试验分析其致病性和耐药性。结果表明,该菌为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae),含有aer、lip、gcat、ser和OMPA I等毒力基因;药敏试验显示其对头孢曲松、氯霉素等7种抗生素高度敏感,对恩诺沙星、阿米卡星及复方新诺明3种抗生素中度敏感,对四环素、环丙沙星等10种抗生素具有耐药性;人工回归感染实验表明该菌具有较高的致病性,对罗氏沼虾的半致死浓度为6.54×10~5 CFU/mL。豚鼠气单胞菌作为水产养殖中的条件性致病菌,研究结果揭示了该菌株的部分生物学特性,有利于丰富豚鼠气单胞菌属的基础数据,同时也为罗氏沼虾养殖过程中的病害防控提供了一定参考依据。

大口黑鲈源豚鼠气单胞菌的分离鉴定及全基因组分析

【目的】探究患病大口黑鲈的致病菌及其主要生物学特性,为临床疾病防控提供技术支撑。【方法】首先对发病大口黑鲈进行病理组织学观察,进而利用平板划线法分离细菌,通过革兰染色、生化试验和16S rDNA序列测定对分离菌进行鉴定,通过致病性试验观察分离菌对小鼠主要脏器造成的病理损伤;而后分别利用PCR方法和Kirby-Bauer(K-B)纸片法对分离菌的常见毒力基因和耐药特征进行检测分析;最后利用二代测序技术绘制其全基因组草图,并通过生物信息学方法对其分子特征进行解析。【结果】自然感染大口黑鲈肝细胞肿大,空泡变性,肠黏膜下层出血,肠壁坏死;于患病黑鲈体内分离到1株优势菌,在血平板上呈乳白色,半透明,直径约1 mm的小菌落,呈β溶血,革兰染色为阴性短杆菌,两端钝圆,经生化试验和16S rDNA测序证实分离菌为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae),将其命名为SCMS。试验小鼠接种后24 h内死亡率为100%,病理特征与自然感染大口黑鲈相似;SCMS株中共检测到9种毒力基因,分别为Aha、Ahp、Aer、Alt、gcaT、Act、Exu、Ela和eprCAI;药敏试验结果显示,分离菌对大多数四环素类、大环内酯类药物表现耐药或中度敏感;全基因组测序显示,分离菌全长4329602 bp,GC含量为61.5%,基因组信息在GenBank中的登录号为JARFUQ000000000,相似性分析显示分离菌与人源、食品源豚鼠气单胞菌具有高度相似性;病原毒力因子数据库(VFDB)比对显示,分离菌携带多种与黏附、侵入及分泌系统相关的毒力基因;耐药基因数据库(CGE)分析显示,菌株中携带7种耐药基因,部分基因与耐药表型存在不一致的现象。【结论】本试验通过全基因组测序技术解析了1株大口黑鲈源豚鼠气单胞菌的毒力基因和耐药基因,其结果可为大口黑鲈临床疾病防控提供技术支撑。

豚鼠气单胞菌研究进展

豚鼠气单胞菌属于气单胞菌属,在自然界中通过食物和水广泛传播,是人、动物和水生生物共患的条件性病原菌,严重危害人类身体健康,同时是造成多种淡水鱼疾病的主要原因,给水产养殖业造成了巨大的威胁。目前,对豚鼠气单胞菌发展的研究,学界很少从系统去概述,论文从豚鼠气单胞菌的病原学、临床特征、流行现状、致病机理及防治等几个方面的最新研究进展进行概述,旨在为其防治及研究提供参考。

维氏气单胞菌拮抗菌株J2-2的筛选、鉴定与效果评价

为筛选对维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)有潜在抑菌作用的菌株,本研究从湖北公安县泥鳅养殖池塘底泥中分离一株细菌J2-2,对其特性进行了研究,并对抑菌活性物质进行了初步分析。结果显示:菌株J2-2为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),具有抑菌广谱性,对米尔伊丽莎白菌(Elizabethella milieri)、嗜水气单胞菌(A.hydrophila)等6种水产病原菌的抑菌直径在9.6~29.5 mm。菌株J2-2的抑菌物质具有较好的酸碱稳定性、热稳定性和蛋白酶K处理的稳定性。电镜结果显示菌株J2-2的发酵产物对维氏气单胞菌的细胞膜结构具有破坏作用。通过LC-MC分析该拮抗细菌可产生至少15种不同的脂肽类化合物如杆菌霉素等。药敏试验结果显示,菌株J2-2对氨苄西林、青霉素具有耐药性,对克林霉素中度敏感,对大多数抗生素高度敏感。

斑点叉尾(Ictalunes punctatus)源中间气单胞菌(Aeromonas media)分离鉴定及药敏特性

从湖南常德某养殖场死亡的斑点叉尾（Ictalunes punctatus）肝脏、肾脏、腹水及血水中分离到一株致病性菌株zy02。对该菌进行了形态特征观察、理化特性测定及分子生物学方法鉴定,用PCR方法同时扩增其16S rDNA和gyrB基因,分析了16S rDNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树。经生理生化测定和16S rDNA与gyrB基因序列分析,zy02株为中间气单胞菌。人工感染该菌后发病鱼表现为与自然发病类似症状,且从组织中再分离的细菌特性与原感染菌相同。腹腔注射后该菌株对斑点叉尾的半致死浓度为3.89×10~6CFU/mL。菌株zy02对多西环素、庆大霉素及左氧氟沙星等高度敏感;对红霉素中度敏感;对阿莫西林、磺胺异噁唑、克林霉素及利福平等5种药物耐药。本研究为斑点叉尾该病防控提供了理论依据。

河川沙塘鳢病原杀鲑气单胞菌致病性及感染后宿主免疫相关基因差异表达分析

为探明2021年3月常熟某养殖场河川沙塘鳢(Odontobutis potamophilus)疾病暴发的原因,本研究从患病鱼体内分离到优势菌株,通过形态观察、理化特性测定及gyrB基因同源性分析鉴定优势菌,同时通过人工感染试验、组织病理观察、毒力因子及毒力基因检测确定其致病性,并测定分离菌的耐药性和感染后河川沙塘鳢免疫相关基因表达变化。结果显示:引起河川沙塘鳢大量死亡的病原菌为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。代表菌株G2-4-1对河川沙塘鳢的LD 50为1.8×106 CFU/mL;该病原菌感染可引起河川沙塘鳢肝脏、脾脏、肾脏和鳃组织出现明显的变性、坏死和炎性细胞浸润;该菌株携带aer、hly、exu等毒力基因,且具有蛋白酶、卵磷脂酶、淀粉酶、脂酶、明胶酶和溶血素活性,但不具有DNA酶活性;耐药性分析发现,分离菌G2-4-1对青霉素G、氨苄西林、苯唑西林等8种药物耐药,对克拉霉素和大观霉素2种药物中介,对恩诺沙星、氟苯尼考等24类药物敏感;免疫相关基因表达分析显示,在感染初期MHCⅡB、MyD88、TLR和SOD在鳃、脾脏和肾脏组织中都显著上调表达。

红鲫豚鼠气单胞菌的分离鉴定与毒力、耐药特性分析

为探究长春市某观赏鱼水产养殖基地患病红鲫的病原及特性,采用菌落特性、理化特征、16S rDNA以及gyrB测序结果相结合的方法对病鱼肝脏组织中分离得到的1株优势菌株CI0701进行分析鉴定;同时,进行回归动物试验、药物敏感性试验、毒力基因及耐药基因检测。鉴定结果表明,该菌与豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)聚类,且同源性高达99%以上;后续试验结果发现CI0701具有较强致病性,对红鲫和斑马鱼的半数致死量(LD_(50))分别为4.3×10^(3)、5.56×10 CFU/尾;该菌对红霉素、四环素、新霉素、氨苄西林、环丙沙星等12种药物耐药,属于多重耐药菌;携带溶血素(hly)、气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、细胞兴奋性肠毒素(alt)、脂肪酶(Lip)、丝氨酸蛋白酶(Ser)和鞭毛蛋白(fla)7种毒力基因;携带氨基糖苷类[ant(3″)-Ia]、四环素类(tetA)、大环内酯类(ermB)、喹诺酮类(qnrS)和β-内酰胺类(bla_(TEM))5种耐药基因。本研究可以为红鲫携带豚鼠气单胞菌的分离鉴定以及治疗提供一定的理论基础。

1株携带bla_(NDM-1)的临床多重耐药豚鼠气单胞菌的基因组及表型鉴定

目的分析从粪便筛查分离出的产NDM-1型碳青霉烯酶的豚鼠气单胞菌(XX182)的抗菌药物耐药表型和基因组特征,阐明该菌株的抗菌药物耐药机制及其耐药性转移的能力。方法肉汤微量稀释法检测该菌株的抗菌药物敏感性,PCR检测碳青霉烯酶耐药基因亚型(bla_(NDM)、bla_(VIM)、bla_(IMP)、bla_(KPC)),接合试验检测耐药基因的可转移性,通过全基因组测序(WGS)和生物信息学分析明确该菌株的基因组特征。结果该菌株对头孢菌素、碳青霉烯类、环丙沙星和多黏菌素耐药,对替加环素、阿米卡星和氨曲南敏感。该菌株携带多种抗菌药物耐药基因,主要包括bla_(NDM-1)、bla_(MOX-6)、bla_(RSA-1)、bla_(TEM-1)、aac(3)-Ⅱd、cmlA5、arr-2等。毒力因子分析发现其携带有极鞭毛、侧鞭毛、Ⅵ型分泌系统(T6SS)和溶血素A等毒力因子。结论该豚鼠气单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药主要由产NDM-1型碳青霉烯酶导致,且bla_(NDM-1)耐药基因位于不可接合质粒上。尽管目前气单胞菌属对碳青霉烯类耐药率较低,但仍应加强对该克隆菌株的监测。

南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物活性与致病性研究

采用琼脂扩散法测定了南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物酶活性和溶血活性,同时对胞外产物的细胞毒性和其致病性进行了研究。结果显示:南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物具有蛋白酶、脂酶、明胶酶和脲酶活性,但不具有淀粉酶和卵磷脂酶活性,具有很强的溶血活性和细胞毒性。肌肉注射感染发现,其对南方鲇有强致病性,其LD50为每千克鱼体重0.802 mg;注射后的南方鲇肌肉、心、肝、肾、脾、肠和胃等组织发生了严重组织病理变化,骨骼肌和心肌坏死断裂,炎症细胞浸润;肝脏严重空泡变性;肾小管上皮细胞变性、坏死、间质内大量炎症细胞浸润;脾充血、出血,淋巴细胞减少,胃肠黏膜上皮细胞变性、坏死、脱落。

十六种中草药及其复方对大鲵致病性豚鼠气单胞菌的体外抑制作用

应用二倍稀释法测定了诃子、五倍子、石榴皮等16种中草药及其复方对大鲵(Andrias davidianus)致病性豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,应用棋盘法设计16种中草药组合的120种双联复方和10种中草药组合的120种三联复方,评估了复方的体外抑菌作用。结果表明:16种中草药对大鲵致病性豚鼠气单胞菌均有一定程度的抑菌作用,抑菌作用强弱依次为诃子、五倍子、石榴皮、大黄、槐角、覆盆子、黄芩、金樱子、肉苁蓉、丁香、川牛膝、赤芍、知母、防风、天葵子及罗汉果;在120个中草药双联复方中,5.8%为显著协同作用,82.6%为协同作用,11.6%为相加作用;在120个中草药三联复方中,29.2%为显著协同作用,87.5%为协同作用。因此,合理的中草药配伍能提高对大鲵致病性豚鼠气单胞菌的体外抑菌作用。

鱼类致病性豚鼠气单胞菌单克隆抗体-胶体金检测方法的建立

以福尔马林灭活的豚鼠气单胞菌按2.5×107个/只和5.0×107个/只分成两个剂量组免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备针对豚鼠气单胞菌的单克隆抗体(McAb),用间接ELISA法对所需的杂交瘤细胞株进行特异性筛选,获得了2株可分泌特异性McAb的杂交瘤细胞,并分别命名为3F3和2C9C3。经过鉴定,这两株McAb能够特异性的针对豚鼠气单胞菌,其抗体亚类分别为IgG1型和IgM型;腹水效价分别为10-6和10-5;相对亲和力较高;3F3针对豚鼠气单胞菌脂多糖表位,而2C9C3针对非脂多糖抗原位点。利用实验制备的McAb建立了以McAb为基础的双抗夹心法膜式超灵敏胶体金快速检测方法,所研制的豚鼠气单胞菌胶体金快速检测卡灵敏度好,特异性高,重复性好,检测时间快,操作简便,为水产上豚鼠气单胞菌的快速鉴定和诊断以及该菌流行的监测提供有力的工具。

克氏原螯虾源致病性豚鼠气单胞菌的分离及其生物学特性

从患病的克氏原螯虾体内分离到一株致病菌L2M-A,经生理生化鉴定和16S rDNA序列分析,证实菌株L2M-A为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)(GenBank登录号:KF446251),其16S rDNA序列与基因库中气单胞菌属菌株的16S rDNA序列有99%—100%的同源性,而且与豚鼠气单胞菌JXZ-3株(GenBank登录号:JF496552)的亲缘关系最近。此外,菌株L2M-A在pH5—9内均能够生长良好,最适生长温度为30℃,最适生长转速为200 r/min,但浓度≥6.25μg/mL的双氟沙星对其生长具有显著的抑制作用,可作为防治用药的依据。

鲟源致病性豚鼠气单胞菌的分离及其生长特性

从患细菌性败血综合征的杂交鲟(Husohuso♀×Acipense rruthenus♂)肝和达氏鳇(H.dauricus)腹水中共分离出4株优势菌,经人工回归感染实验测定了其致病性,并通过ATB细菌鉴定仪对致病菌株进行了鉴定,此外,研究了致病菌株的生长特性。实验结果表明,菌株XL2-T对杂交鲟和达氏鳇具有致病性。经鉴定,菌株XL2-T为豚鼠气单胞菌(Aeromonas punctata caviae);其在无菌营养肉汤中摇床振荡培养时的生长曲线:0～1.5h为生长延迟期,1.5～28h为对数生长期,28～32h为稳定期,32h以后为衰亡期;其最适生长温度为25～30℃,最适生长pH为7,在NaCl含量范围0～10%、沙拉沙星浓度范围0～40μg/ml下均能够生长,但NaCl、沙拉沙星对其生长具有较大的抑制作用。

南方鲇(Silurus meridionalis)豚鼠气单胞菌溶血素的分离、纯化与致病性研究

采用硫酸铵盐析、DEAE-Sephadex A50凝胶层析法对豚鼠气单胞菌的溶血素进行分离、纯化,获得分子量为32.2kDa的单一多肽溶血素,测定溶血价为25。将该溶血素倍比稀释后梯度接种南方鲇,研究其对南方鲇的致病性和组织病理损伤情况。结果表明:豚鼠气单胞菌溶血素具有较强的毒力,对南方鲇的半数致死剂量(LD50)为0.29mg蛋白/kg体重;病鱼表现为体表褪色,腹部膨大,肝、脾、肾肿大,肝、脾淤血、出血明显;胃肠道内充有大量粘液,黏膜充血、出血;组织病理学表现为骨骼肌水肿、变性,肝细胞变性、坏死,血窦扩张淤血,肾小管上皮细胞变性、坏死,脾脏淋巴细胞减少,胃肠道黏膜上皮变性、坏死,脱落。

豚鼠气单胞菌胶体金免疫层析试纸条的研制

采用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体分泌细胞株,获取抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体,柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金颗粒,选择直径20 nm的胶体金颗粒,标记抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体并制备胶体金垫。将胶体金垫与喷涂有抗豚鼠气单胞菌兔多克隆抗体和羊抗鼠抗体的硝酸纤维素膜及样品吸收垫等组装成免疫层析试纸条,建立豚鼠气单胞菌的快速检测方法。用灭活细菌与血清混合的模拟样本测定试纸条的特异性、灵敏度,结果显示,试纸条对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌等13种常见病原菌没有交叉反应,与豚鼠气单胞菌显示特异性反应,检测灵敏度为1×106CFU/mL,结果显示时间小于5 min。研制的豚鼠气单胞菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高、适用于基层临床生产推广应用等优点。

观赏金鱼豚鼠气单胞菌的分离鉴定及防治

从陕西省某观赏鱼养殖场发生出血病的金鱼中分离到一株细菌,通过培养特性、菌体形态、菌落特征、染色特性、生化试验等一系列的系统鉴定,确定为豚鼠气单胞菌。动物致病性试验表明,该菌对小白鼠和金鱼有较强的致病性,可引起其死亡。药敏试验证明该菌对四环素、庆大霉素、氯霉素等高度敏感,对氟哌酸、链霉素等中度敏感,对红霉素、青霉素等不敏感。通过药敏试验选用有效抗生素,有效地控制了该病的流行。

鲢鳙打印病豚鼠气单胞菌主要特性及系统发育学分析

对从鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)鳙(Aristichthysnobilis)打印病病死鱼中分离到的豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae),进行了形态与理化特性等方面较系统的表观分类学指征鉴定。同时择代表菌株(HC960704-1)进行了16SrRNA基因的分子鉴定,测定了16SrRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树;HC960704-1的16SrRNA基因序列长度为1416bp(GenBank登录号:AY966888),与GenBank数据库中的气单胞菌16SrRNA基因序列的相似性在98%和100%。

中华绒螯蟹豚鼠气单胞菌的分离和鉴定

对杭州转塘患“抖抖病”的中华绒螯蟹进行了病原的分离和鉴定 ,从病蟹体内分离到两株病原菌 ,均属革兰氏阴性杆菌 ,单极生鞭毛 ,运动 ,兼性厌氧 ,发酵葡萄糖产酸不产气 ,氧化酶、七叶苷、过氧化氢酶阳性 ,能还原硝酸盐等 ,其形态特征及生理生化反应与豚鼠气单胞菌基本相同 ,故鉴定为豚鼠气单胞菌 .人工注射感染健康蟹后 ,均在 3d内死亡 ,死亡率为 10 0 %,证实豚鼠气单胞菌为中华绒螯蟹的致病菌 .药敏试验结果表明 ,此病原菌对链霉素、卡那霉素、新霉素、环丙沙星、氟哌酸、氯霉素、庆大霉素、妥布霉素、氟嗪酸、壮观霉素、复达欣、头孢呋肟、菌必治、萘啶酸、呋喃妥因等药物高度敏感 .

中草药体外抑杀大鲵致病性豚鼠气单胞菌的药效研究

筛选对大鲵致病性豚鼠气单胞菌有抑菌作用的中草药。采用琼脂打孔法,测定中草药在不同pH值时对大鲵致病性豚鼠气单胞菌的体外抑菌圈效果。使用二倍稀释法,测定中草药在不同pH值时对大鲵致病性豚鼠气单胞菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度。试验结果表明,200种中草药对大鲵致病性豚鼠气单胞菌的抑菌效果各不相同,其中135种中草药具有一定抑菌作用,其余65种无抑菌作用,而不同pH值时抑菌效果亦有所不同。药液为酸性时,乌梅、五味子、五倍子及诃子的抑菌效果极强,抑菌圈明显。135种中草药对豚鼠气单胞菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度亦有所差异,其中,诃子、五倍子、石榴皮、大黄及槐角的最小抑菌质量浓度小于1mg/mL,抑菌作用最强。本试验筛选出具有很强抑菌作用的中草药。