貉细小病毒LN10-1株分离鉴定及其免疫原性研究

为研制貉细小病毒性肠炎疫苗,筛选出针对貉细小病毒性肠炎免疫原性好、安全高效的疫苗备选株,应用CRFK细胞从辽宁省发病貉的粪便中分离病毒,并通过形态学、血清学、分子生物学、动物回归及免疫接种等方法对分离株进行鉴定。鉴定结果表明成功分离出1株貉细小病毒,命名为LN10-1株。其VP2基因核苷酸序列与猕猴源猫泛白细胞综合征病毒株(BJ-22/2008/CHN株)相似性高达99.7%。VP2蛋白上决定宿主范围的2个氨基酸位点发生了突变。VP2基因种系发生分析显示,LN10-1株位于猫泛白细胞综合征病毒(Feline panleukopenia virus,FPLV)、蓝狐细小病毒(Blue fox parvovirus,BFPV)、水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)组成的食肉类动物细小病毒聚类分支与由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)组成的聚类分支。由LN10-1株制备的灭活疫苗免疫结果显示,接种28d细小病毒中和抗体滴度可达到1∶256以上。推测LN10-1株可能正处于FPLV与CPV进化的中间状态,或是CPV适应新宿主(貉)而形成的一种新病毒,可以作为针对貉细小病毒性肠炎灭活疫苗的候选株。

貉细小病毒HLJ11-1株的分离鉴定及VP2基因序列分析

为了研究貉细小病毒,试验从来自黑龙江省的疑似貉细小病毒感染貉的病料分离出1株貉细小病毒(Raccoon dog parvovirus,RDPV),进行了形态学、血清学、生物学和病毒分子生物学鉴定,并对分离株VP2基因进行克隆和序列分析。结果表明:分离的病毒为CPV突变株;该株病毒与肉食动物细小病毒有很高的同源性,属于CPV-2a突变株,命名为RDPV HLJ11-1,接近于CPV-2型毒株。说明RDPV HLJ11-1株可能正处于猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)与犬细小病毒(CPV)进化的中间状态,或是为CPV适应新宿主(貉)而形成的一种新病毒,可以作为针对貉细小病毒性肠炎灭活疫苗的候选株。

貉细小病毒的原核表达及病毒样颗粒的制备

为了利用大肠杆菌系统可溶性表达貉细小病毒(Raccoon dog parvovirus,RDPV)的衣壳蛋白VP2,获得RDPV病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),试验首先通过密码子优化并合成RDPV VP2基因,构建重组表达质粒pET30a-VP2,转化至E.coli ER2566感受态细胞中;SDS-PAGE电泳检测目的蛋白RDPV VP2的表达形式;将重组表达质粒pET30a-VP2与分子伴侣质粒pTf16共同转入E.coli ER2566感受态细胞中,并优化最佳诱导表达条件;采用Western-blot技术鉴定目的蛋白的可溶性;经硫酸铵初级纯化后,电镜观察VLPs的形态,并采用血凝试验检测其免疫活性。结果表明:目的蛋白RDPV VP2得到了大量表达,并且大部分以可溶性形式表达,最佳诱导条件为30℃、0.1 mmol/L IPTG和2.0 g/L L-阿拉伯糖;犬细小单克隆抗体可以特异性识别目的蛋白RDPV VP2;30%硫酸铵沉淀初级纯化后,电镜观察可见到均一的、大小为24 nm左右的RDPV VLPs,其形态学结构与天然RDPV VLPs形态相似,血凝效价为2^23。说明分子伴侣可有效提高目的蛋白RDPV VP2的可溶性表达量,并成功制备出RDPV VLPs。

貉细小病毒SD1607株的分离鉴定及VP 2基因序列分析

从疑似患细小病毒性肠炎的貉子肠道组织样品中分离到一株貉细小病毒(RDPV-SD1607)。为研究其分子遗传特征,对该分离株VP2基因进行克隆序列分析,结果显示,RDPV-SD1607的VP2序列与RDPV-HB3的相似性最高,为99.49%,属于CPV-2亚型;利用其核苷酸序列建立系统进化树发现,RDPV-SD1607处于犬细小病毒分支,且处于CPV-2亚型和CPV-2a亚型分支之间。结果表明,RDPV-SD1607株与犬细小具有共同的遗传起源,推测其可能正处于CPV-2亚型向CPV-2a亚型进化的中间状态,或是CPV适应貉而形成的新毒株。

貉细小病毒RDPV-JL3株的分离鉴定及VP2基因序列分析

本试验从吉林省某养殖场疑似患貉细小病毒的貉肠道组织中成功分离出1株貉细小病毒(Raccoon dog parvovirus,RDPV),将其命名为RDPV-JL3株。对其VP2基因进行克隆测序和序列分析,结果表明,VP2核苷酸基因序列与RDPV HeB10-3(KJ194463)株相似性为100%,属于CPV-2亚型。系统进化树表明其与RDPV HeB10-3株和RDPV-17-JL-9(MH581183)株处于同一进化分支且与CPV-Vac1疫苗株亲缘关系密切。本研究为更好地在本地区开展貉细小病毒流行病学调查提供了有益借鉴,也为深入研究貉细小病毒变异和传播的分子机制奠定了基础。

貉细小病毒分离鉴定及其VP2基因序列分析

本研究从山东省某貉养殖场发病貉粪便样品中分离到一株貉细小病毒(raccoon dog parvovirus,RDPV)。为了解该毒株的特性及其致病特点,对发病貉粪便处理后接种F81细胞,收获病毒液进行VP2基因序列分析、理化特性研究以及貉人工感染试验。结果显示:该分离株与RDPV参考株核苷酸同源性高达99.4%,属于犬细小病毒2型(CPV-2);对氯仿等不敏感,耐酸耐热,符合细小病毒特征;分离毒株对貉具有较强的致病力。结果表明,山东省仍存在RDPV流行且致病性有增强风险,须针对性研发RDPV疫苗,加强对RDPV流行的控制。本试验为RDPV流行病学研究提供了数据支持。

貉细小病毒与犬细小病毒和水貂细小病毒的抗原差异性分析

为了确定貉细小病毒(RDPV)与同属的犬细小病毒(CPV)和水貂细小病毒(MEV)之间的抗原差异性。用RDPV、CPV和MEV 3种阳性血清分别与RDPV(HB01株)、CPV(BJ株)和MEV(GL株)3种病毒测定中和抗体效价;另外,将实验室制备的RDPV、CPV及MEV灭活疫苗分别免疫5只健康易感貉,同时设立5只作为未免疫对照组。免疫后第21天所有实验貉攻击RDPV强毒测定保护率。中和试验显示,3种阳性血清对RDPV、CPV和MEV的中和抗体效价差异均不超过1倍(1:512~1:1280)。免疫保护试验中,HB01株免疫组保护率为5/5;BJ株免疫组保护率为3/5;GL株免疫组保护率为2/5;对照组5/5发病。RDPV、CPV和MEV存在抗原性差异性,HB01株免疫貉针对RDPV攻毒可以提供完全保护。

貉源细小病毒(RDPV)HeB17株的分离鉴定及基因组序列分析

为了解我国河北省貉细小病毒(RDPV)生物学特性,通过细胞培养从河北省某貉养殖场发病貉组织样品中分离到1株病毒,经病料样品的PCR鉴定、病毒分离培养及形态学观察、猪红细胞凝集试验、基于VP2基因建立的系统发生树分析、同源性分析、动物回归试验等方法对分离株进行鉴定。结果显示,用特异性引物对病料样品进行PCR鉴定,可扩增得到573 bp特异性条带;分离病毒可在F81细胞中进行培养并产生明显的CPE;电镜下可见25 nm左右细小病毒样病毒粒子;猪红细胞凝集试验(HA)结果显示,分离株对猪红细胞血凝效价可达到1∶1024;VP2基因序列比对及进化分析结果显示,RDPV-HeB16与RPDV-LN10-1处于同一进化分支;同源性分析结果显示,与参考序列VP2基因相似性在98.4%~99.5%之间;将病毒培养物感染健康貉,结果显示感染组的貉均出现典型RDPV临床症状,正常对照组未发病。综上所述,本研究结果表明从发病貉病料样品中分离到1株RDPV,命名为RPDV-HeB17。本研究所获数据将对我国RDPV的流行及该病毒的遗传进化分析、疫苗和诊断制品的研究提供参考。

临床医学

S854.43 961210病毒提纯方法的比较试验/裴天云(兰州军区后勤部军事医学研究所 730020),侯顺利,赵改敏…//中国兽医科技.-1995,25(7).-21～22用于提纯病毒抗原的方法有差速离心法、葡聚糖凝胶层析法、硫酸铵沉淀法等.