苹果内根-贝壳杉烯氧化酶基因的克隆及序列分析

内根-贝壳杉烯氧化酶(KO)是赤霉素合成代谢的关键酶。以苹果(Malus×domestica Borkh.)品种富士(Fuji)为供试材料,应用同源克隆和RACE方法从其茎尖中克隆到KO的cDNA全长序列,命名为MdKO,GenBank登录号:AY563549,其长度为1 859 bp。MdKO的开放性阅读框(ORF)编码514个氨基酸残基,推断其相对分子量为58.9 ku,等电点为7.63。氨基酸同源性分析表明,MdKO与已报道的其他植物的KO氨基酸序列具有较高的相似性;氨基酸聚类分析表明,苹果和梨首先聚类,其次是葡萄;序列结构分析表明MdKO属于细胞色素超家族P450系,具有细胞色素P450的血红素结构域FXXGXRXCXG和跨膜结构域;亚细胞定位分析发现MdKO可能位于内质网膜上。

草莓中贝壳杉烯氧化酶基因(STGA3)中两个不同编码序列的克隆

以保守氨基酸序列设计了简并性引物的方法,克隆‘丰香’草莓(Fragaria gradiflora‘Fengxiang’)贝壳杉烯氧化酶基因部分序列,发现叶片和花蕾中合成赤霉素的贝壳杉烯氧化酶的序列不同,Southern杂交方法检测在草莓基因组中存在3个拷贝的目标基因,表明在草莓中至少有两个不同基因共同编码贝壳杉烯氧化酶,以响应不同发育信号的调控。

山核桃贝壳杉烯氧化酶基因CcKO的克隆和表达分析

【目的】内根-贝壳杉烯氧化酶(KO)是赤霉素(GAs)生物合成途径关键酶,也是植物GAs生物合成抑制剂多效唑的靶酶,若GAs生物合成途径中在KO基因位点发生阻塞,会影响植株的正常生长。本研究克隆山核桃CcKO基因(Caca0733S0131)及其启动子并进行表达分析,以利于进一步探究山核桃CcKO基因在植物生长和发育过程中,尤其是与株高调控相关的生物学功能,从而助力山核桃优新种质的创制。【方法】以山核桃体细胞胚为试验材料,采用同源重组及PCR扩增技术,克隆获得山核桃KO的基因及启动子序列,并进一步构建了具有强启动子的35S∷CcKO∷GFP过表达载体和CcKOpro∷GUS启动子表达载体;利用BLAST在线工具得到该基因编码的氨基酸序列,并对其进行生物信息学分析和同源性分析;进一步通过农杆菌介导法将启动子表达载体及过表达载体转入核桃体细胞胚并进行植株再生试验,分别获得阳性再生植株,从而深入分析山核桃CcKO基因的生物学功能。【结果】通过克隆,获得1条山核桃CcKO开放阅读框,其全长为1563 bp,共编码520个氨基酸,相对分子量为59.076 kDa。氨基酸同源性分析表明,山核桃CcKO含有细胞色素P450核心功能域FXXGXRXCXG和氨基端的跨膜结构域。BLAST结果表明,山核桃CcKO氨基酸序列与核桃JrKO氨基酸序列同源性为96%,与白梨、苹果、板栗、欧洲栓皮栎的氨基酸同源性分别为71%、79%、77%、76%。对核桃体细胞胚进行遗传转化:启动子表达经GUS染色和PCR验证表明,CcKOpro∷GUS启动子表达载体被成功转入核桃体细胞胚中,且山核桃CcKO基因主要定位于维管束中;过量表达经荧光检测显示及PCR验证表明,35S∷CcKO∷GFP过表达载体被成功转入核桃体细胞胚中;表型分析结果显示,阳性再生植株株高显著高于对照,且山核桃CcKO基因的表达丰度越高,其株高越高;实时荧光定量PCR及相关分析表明,该基因表达具有空间差异,茎中表达量显著高于其他组织部位,且过量表达可使核桃阳性再生植株GAs合成通路下游GA20ox表达量升高而GA2ox表达量下降。【结论】山核桃CcKO基因编码区全长1563 bp,编码520个氨基酸,该基因所编码的氨基酸序列与核桃JrKO氨基酸序列同源性最高,同源性为96%;启动子表达载体定位结果表明该基因主要定位于维管束。过量表达山核桃CcKO基因的核桃再生植株中,KO mRNA表达量明显升高,植株表现出明显的伸长特征,并且CcKO过量表达可使其GA20ox表达量上调,GA2ox表达量下调。本研究结果可为进一步分析KO基因在山核桃及核桃生长发育过程中的作用提供参考。

梨贝壳杉烯氧化酶基因PpKO的克隆及生物信息学分析

以黄金梨(Pyrus pyrifolia Nakai)茎尖为试材,应用同源克隆和RACE方法从梨茎尖中克隆到赤霉素合成代谢的关键酶:内根-贝壳杉烯氧化酶(KO)基因cDNA的全长序列,命名为PpKO,GenBank登录号为:HM003112,其长度为1752bp。PpKO的开放阅读框(ORF)编码515个氨基酸,相对分子量为59.007kD,等电点为7.19。氨基酸同源性分析表明,PpKO与已报道的其它植物的KO氨基酸序列具有59.4%～95.9%相似性;氨基酸聚类分析表明,梨和苹果首先聚类,其次是草莓;生物信息学分析表明:PpKO含有细胞色素P450核心功能域FXXGXRXCXG和氨基端的跨膜结构域。

基于梨贝壳杉烯氧化酶基因PpKO序列的功能性SNP标记

基于基因序列的功能性标记是基因分型、图谱定位和相关性状标记辅助选择的理想标记。以'矮生梨'×'茌梨'的梨杂交分离群体和9个梨栽培品种为试材,以梨赤霉素合成代谢途径的关键酶基因--贝壳杉烯氧化酶基因(PpKO)的cDNA序列为基础,设计5对PCR引物,通过高通量熔解曲线(high resolution melting,HRM)分析,筛选到可对基因进行良好分型的1对引物。通过对杂种后代和测试品种的测序分析表明,此对引物的扩增子是一个位于PpKO第8外显子上的长度为200bp的序列,从中共检测到两处单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)变化,且均为非同义cSNP。这两处SNP标记均可以作为适合高通量分析的遗传标记在遗传作图、基因定位或资源鉴定中加以利用。

黄瓜贝壳杉烯氧化酶基因CKO的克隆及其表达分析

以‘戴多星’黄瓜为试材,应用同源克隆和RACE技术从茎尖中得到赤霉素合成的关键酶——贝壳杉烯氧化酶(KO)基因cDNA全长序列,命名为CKO,GenBank登录号为JN792591,其长度为1 895 bp,开放阅读框(ORF)编码519个氨基酸,相对分子量为59.211 kD,等电点(PI)8.45。氨基酸同源性分析发现,CKO与苦瓜的KO同源性最高,达84%;序列结构分析表明,CKO属于细胞色素超家族P450系,具有细胞色素P450的血红素结构域FXXGXRXCXG和跨膜结构域。实时荧光定量分析表明,CKO在遮荫的徒长苗中表达量最高,是正常苗的5.18倍,在遮阴条件下喷施多效唑可降低期表达。

丹参类贝壳杉烯氧化酶(SmKOL)基因全长克隆及其生物信息学分析

根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆类贝壳杉烯氧化酶(Sm KOL)全长c DNA,并进行生物信息学分析;采用实时定量PCR检测茉莉酸甲酯(Me JA)诱导丹参毛状根不同时期的Sm KOL表达水平。克隆得到的Sm KOL全长c DNA由1 884个核苷酸组成,具有完整编码框,编码519个氨基酸,蛋白相对分子质量约为58.88 k Da,等电点p I 7.62;实时定量PCR结果表明该基因受Me JA诱导后,表达水平在36 h时达到最大值。从丹参毛状根中克隆得到1条Sm KOL全长c DNA,为进一步研究该基因的功能和丹参次生代谢调控机制提供了靶基因。

梨茎尖中PpKO基因表达量的实时荧光定量PCR分析

以黄金梨不同发育时间的新梢茎尖为试材,应用实时荧光定量PCR技术,对18S rRNA、Actin、GAPDH和S19这4个常用内参基因在梨茎尖组织中的表达稳定性进行了评估。GeNorm软件分析显示,它们表达稳定度的平均值(M)依次是0.365,0.392,0.457和0.517,即表达稳定性从高到低的排序是:Actin>18S rRNA>GADPH>S19。选择Actin作为校正内参基因,对处于不同发育时期的新梢茎尖组织中贝壳杉烯氧化酶基因PpKO的表达量进行研究,发现该基因在新梢生长过程中出现2次表达高峰,基本与春梢、秋梢的快速生长期吻合,且秋梢中的表达量远高于春梢。

利用SMART RACE克隆STGA3 cDNA的5′末端

阐述了SMART RACE的原理,克隆了草莓贝壳杉烯氧化酶基因(STGA3)5′端未知序列。所得到的STGA3 cDNA的5′末端共有1 474 bp,其中非编码区共34 bp,编码区1 440 bp,编码氨基酸480个,此序列在NCBI的注册号为:AY462247。它与已克隆到的同源基因拟南芥GA3和南瓜CYPT01A1之间的同源性分别为56.9%和59.2%。

石榴赤霉素合成相关基因PgKO的克隆及表达分析

该研究以‘红玉石籽’(Punica granatum cv.Hongyushizi)石榴为试验材料,采用RT-PCR和RACE技术,从石榴花中克隆得到赤霉素合成关键酶——内根贝壳杉烯氧化酶(KO)基因,命名为PgKO(GenBank登录号为MG208017)。PgKO全长cDNA为1 729bp,包含1 542bp开放阅读框(ORF),编码513个氨基酸,相对分子量为141.16kD,理论等电点为4.9。多重序列对比显示,PgKO与苹果MdKO、白梨PcKO、葡萄VvKO的相似性分别为61.28%、64.56%和73%,并且具有CYP450结构域(脯氨酸富含域、氧还原位点和血红素结合域)。系统进化树分析表明,PgKO与其他物种的起源相同,并与桉树EgKO的亲缘关系最近。荧光定量PCR发现,在石榴蕾期和盛花期,PgKO基因的表达量均为筒状花高于钟状花,且PgKO基因在两种花型的子房、花药、花萼中均有表达,但筒状花中子房的表达量最高,花萼的表达量最低;钟状花中花药的表达量最高,子房的表达量最低。

板栗野生和芽变雄花序赤霉素合成关键酶基因比较分析

为探明芽变雄花序赤霉素含量降低的分子机制,对板栗野生和芽变雄花序赤霉素合成关键酶基因古巴焦磷酸合成酶(CPS)、贝壳杉烯合成酶(KS)、贝壳杉烯氧化酶(KO)、贝壳杉烯酸氧化酶(KAO)、赤霉素20-氧化酶1(GA20ox1)和赤霉素3-氧化酶1(GA3ox1)的cDNA序列,以及KO基因DNA序列进行了比对,结果表明:两类花序中KO基因在开放阅读框的872、1 115和1 150bp存在3处碱基差异,分别造成了氨基酸由Glu、Tyr和Tyr突变为Gly、Phe和His,最终导致了跨膜区的改变,且发现cDNA上碱基突变是由DNA的碱基差异造成的。推测KO基因的这种突变导致板栗短雄花序性状。